馮瑜菲 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
2000 年，Notomi T 等發(fā)明了一種新穎的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），其特點(diǎn)是在等溫條件下即可高效、快速、高特異性、高靈敏度的擴(kuò)增靶序列。目前，該方法已在很多畜牧相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，包括傳染性疾病的診斷、病原微生物的檢測、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)及環(huán)境監(jiān)測等。
1. LAMP 的引物設(shè)計(jì)
LAMP 反應(yīng)是一種嶄新的 DNA 擴(kuò)增方法，針對靶序列的 6 個特異性區(qū)域設(shè)計(jì) 4 條特殊引物，利用 Bst DNA 聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)動力，在恒溫條件下完成對靶基因的大量擴(kuò)增。4 條引物中包括 2 條內(nèi)引物和 2 條外引物。內(nèi)引物 FIP（forward innerprime）包含 F1c 序列和 F2（F2c 區(qū)域的互補(bǔ)序列），BIP（backward inner primer）包含 B1c（B1 區(qū)域的互補(bǔ)序列）和 B2 序列。F1c 和 B1 為分別位于 F2c 和 B2 內(nèi)側(cè)，F(xiàn)2c 和 B2 為擴(kuò)增片段兩端長度為 18nt~24nt 的特異序列，F(xiàn)3c 和 B3 為分別位于 F2c 和 B2 外側(cè)。擴(kuò)增的靶序列的長度最好在 300bp 以內(nèi)，超過 500bp 長度的序列擴(kuò)增效率較低。
2 LAMP 的原理
LAMP 的反應(yīng)溫度為 60~65℃，該溫度是 DNA 雙鏈復(fù)性和延伸的中間溫度，DNA 在此溫度處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物向雙鏈 DNA 的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。LAMP 反應(yīng)可分為三個階段，即起始階段、擴(kuò)增循環(huán)階段以及延伸和再循環(huán)階段。
第一階段：起始階段。在鏈置換型 Bst DNA 聚合酶的作用下，以 FIP 引物 F2 區(qū)段的 3’末端為起點(diǎn)，與模板 DNA 互補(bǔ)序列配對，啟動鏈置換 DNA 合成。F3 引物與 F2c 前端 F3c序列互補(bǔ)，以 3’末端為起點(diǎn)，通過鏈置換活性 DNA 聚合酶的作用，一邊置換先頭 FIP 引物合成的 DNA 鏈，一邊合成自身 DNA，如此向前延伸。最終 F3 引物合成而得的 DNA 鏈與模板 DNA 形成雙鏈。由 FIP 引物先合成的 DNA 鏈被 F3 引物進(jìn)行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，這條單鏈在 5’末端存在互補(bǔ)的 Flc 和 Fl 區(qū)段，于是發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時，BIP引物同該單鏈雜交結(jié)合，以 BIP 引物的 3’端為起點(diǎn)，合成互補(bǔ)鏈。在此過程中環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開。接著，與 F3 類似，B3 引物從 BIP 引物外側(cè)插入，進(jìn)行堿基配對，以 3’端為起點(diǎn)，在聚合酶的作用下，合成新的互補(bǔ)鏈。通過上述兩過程，形成雙鏈 DNA。而被置換的單鏈DNA 兩端均存在互補(bǔ)序列，自然發(fā)生自我堿基配對，分別形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是 LAMP 反應(yīng)基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。
第二階段：擴(kuò)增循環(huán)階段。首先在啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，以 3’末端的 Fl 區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行 DNA 合成延伸。與此同時，F(xiàn)IP 引物 F2 與環(huán)上單鏈 F2c 雜交，啟動新一輪鏈置換反應(yīng)。解離由 Fl 區(qū)段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)上存在單鏈形式 B2c，BIP 引物上的 B2 與其雜交，啟動新一輪擴(kuò)增。
第三階段：延伸和再循環(huán)階段。在新一輪擴(kuò)增啟動后，經(jīng)過相同的過程，又可形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。如此往復(fù)循環(huán)，形成一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過此過程，同一條鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。
此外，Notomi 等人通過設(shè)計(jì)的 Loop 引物（LF、LB）來進(jìn)一步加快 LAMP 反應(yīng)的效率。Loop 引物結(jié)合的區(qū)域在 F2 和 Fl 之間或是 B2 和 B1 之間，以 Fl 到 F2 的方向或是 Bl 到 B2的方向結(jié)合。Loop 引物通過與啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)雜交，啟動鏈置換 DNA 的合成。而已經(jīng)和內(nèi)引物 FIP 或 BIP 雜交的莖環(huán)則不能再與 Loop 引物雜交。這樣，所有的莖環(huán) DNA 或者與內(nèi)引物雜交，或者與 Loop 引物雜交，從而加快了反應(yīng)速度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，使用 Loop 引物的 LAMP反應(yīng)具有更高的敏感性，反應(yīng)時間也可比原來的 LAMP 反應(yīng)縮短近一半的時間。
