顧江萍 上海交通大學(xué)
重組活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒(常為疫苗弱毒株)構(gòu)建成一個(gè)載體，把外源基因(包括重組多肽、肽鏈抗原位點(diǎn)等)插入其中使之表達(dá)的活疫苗。獸醫(yī)使用該類疫苗免疫動(dòng)物時(shí)，其向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式與自然感染時(shí)的真實(shí)情況很接近，可誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的免疫，它具有活疫苗的免疫效力高、成本低及滅活疫苗的安全性好等優(yōu)點(diǎn)。因此用活載體表達(dá)TGEV的相關(guān)研究較多，疫苗取得了不錯(cuò)的效果。但是在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，減毒微生物可能會(huì)引起免疫抑制，建立潛伏感染，同時(shí)存在毒力恢復(fù)和外源基因表達(dá)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。而無毒的微生物則存在免疫原性差，難以激起機(jī)體有效免疫保護(hù)的問題。因而，解決載體的安全性、免疫原性是建立有效重組活載體疫苗的關(guān)鍵。
1.乳酸桿菌載體
乳酸桿菌易培養(yǎng)，遺傳操作方法成熟、簡便、效率高，并且重復(fù)性好?？诜娜樗釛U菌安全性高，可將特異性抗原分子攜帶至腸道，穿過腸壁進(jìn)入粘膜下層，進(jìn)而引起細(xì)胞免疫和體液免疫，對機(jī)體有極強(qiáng)的黏附作用，乳酸菌表達(dá)的具有治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷地在黏膜處產(chǎn)生，持續(xù)向機(jī)體釋放抗原蛋白，有效引起機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫耐受，是一種極具廣闊應(yīng)用前景的疫苗載體。近年來，乳酸菌表達(dá)載體系統(tǒng)的研究已顯示出優(yōu)越性。
P.S.Ho等將TGEV的S基因克隆到乳酸桿菌，大腸桿菌穿梭載體中，將表達(dá)分泌S蛋白的乳酸桿菌經(jīng)口免疫BALB／c小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生局部粘膜免疫和全身免疫應(yīng)答，32d后在小鼠血清中檢測到IgG含量為(8.38±0.19)ng／mL，腸道中IgG含量為(64.82±2.9)ng／mL，說明該疫苗可有效預(yù)防TGEV感染。唐麗杰等以乳酸乳球菌為載體表達(dá)了TGEV的S基因片段，口服免疫BALB／c小鼠，能夠產(chǎn)生明顯的sIgA抗體。
2.DNA載體疫苗
DNA疫苗即把一個(gè)或幾個(gè)抗原蛋白的編碼基因克隆到真核表達(dá)載體上，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入機(jī)體內(nèi)，使編碼基因借助宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制獲得表達(dá)，進(jìn)而激活機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。DNA疫苗的結(jié)構(gòu)十分簡單，它主要由大腸埃希菌來源的質(zhì)粒組成，沒有感染性，只編碼目的蛋白質(zhì)而不包含其它病毒或細(xì)菌蛋白質(zhì)。
KristopHerM等用綠色熒光蛋白替換TGEV基因組ORF3a，構(gòu)建成TGEV-GFP重組體轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，能夠分離到有效表達(dá)綠色熒光蛋白的TGEV-GFP重組體。任曉峰等應(yīng)用pCI新型真核融合表達(dá)載體分別表達(dá)TGEVTH298株的全長S基因和主要抗原位點(diǎn)(A、C、D)片段，構(gòu)建了含有TGEV全長S基因及其主要抗原位點(diǎn)區(qū)的核酸疫苗，將重組疫苗免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)后者的免疫效果優(yōu)于重組前。
楊恒等將TGEVSC-H株S基因5’端主要抗原位點(diǎn)片段和N基因，插入pMD19-T載體，經(jīng)酶切與測序鑒定后，構(gòu)建重組質(zhì)粒。從T載體上將S、N基因切下，以亞克隆方法插入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建嵌合表達(dá)S、N基因的重組質(zhì)粒pVAX-S-N。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外源基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確且在COS7細(xì)胞中得到表達(dá)。真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S-N的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
