顧江萍 上海交通大學
1.桿狀病毒載體
桿狀病毒基因組較大，易插入外源DNA片段，對脊椎動物細胞無致病性，重組桿狀病毒載體安全性高，獸醫(yī)領域應用十分廣泛。
Shoup等將TGEV的S基因插入桿狀病毒轉染到質粒PVL941的啟動子下游附近，與經酶切線性化的桿狀病毒DNA共同轉染sf9細胞，經空斑篩選獲得高效表達的重組桿狀病毒，該表達產物與弗氏完全佐劑配制的抗原免疫Lewis大鼠，能夠產生高效價的中和抗體。
Tuboly等將TGEVS基因的7個片段和全長S基因的cDNA片段克隆在桿狀病毒載體中表達。重組病毒免疫乳豬后，發(fā)現S基因中5’端包含4個主要抗原位點片段的重組病毒誘導的病毒中和抗體與全長S蛋白誘導的抗體相當。還發(fā)現只有結構中包含抗原位點A的S糖蛋白才能產生高滴度的中和抗體，缺乏位點A、D的重組體不能誘導與全長S蛋白誘導的中和抗體一樣的抗體水平。
GodetM.等用桿狀病毒為載體在昆蟲細胞中表達S基因，表達產物與弗氏完全佐劑配制成疫苗，免疫35d齡路易斯鼠，能夠產生高效價的中和抗體；12d后，鼠血清中和試驗的效價達1:2500；用表達的S糖蛋白作為弱毒苗免疫妊娠母豬后的加強免疫，可顯著提高母豬血清和初乳的抗體水平，其對仔豬的保護率比弱毒苗兩次免疫還高14%，但S蛋白亞單位苗單獨免疫效果不佳。
2.減毒沙門氏菌載體
近年來，以減毒細菌為載體攜帶DNA疫苗進行口服免疫被證實是激發(fā)粘膜免疫的一種理想途徑。減毒沙門氏菌是通過物理、化學或基因工程等方法，使沙門氏菌某些特定的基因發(fā)生不可逆的突變。使其毒力大大降低，感染宿主細胞后可在體內生長繁殖。沙門氏菌是一種侵襲性胞內菌，可用其作為疫苗載體攜帶原核表達質粒和真核表達質粒，重組減毒沙門氏菌疫苗制備簡單，免疫方便，有較強的免疫原性，能誘導持久的免疫反應，尤其可誘導較強的黏膜免疫反應。減毒沙門氏菌載體由于其特殊的優(yōu)點而被廣泛應用于疫苗研究。
SmerdouC等用減毒沙門氏菌為載體表達TGEV的S基因，由于表達的蛋白缺少糖基化依賴的構象免疫決定簇A，接種鼠、兔、豬后，均產生低水平的或
者沒有產生中和抗體，將表達的蛋白包被糖基化依賴的抗原決定簇(位點A，B)，接種動物則能夠產生各種水平的中和抗體和保護力。
楊恒等也通過減毒沙門氏菌為載體，成功構建了攜帶TGEVDNA疫苗的活載體口服疫苗，并顯示出良好的免疫原性和安全性。HuaiqingChen等將TGEVS基因的A位點和C位點插入到鼠傷寒沙門氏菌苗的菌毛中，經口免疫BALB/c小鼠，發(fā)現誘導的抗體能識別TGEVS蛋白的抗原位點。
3.痘病毒和腺病毒載體
痘病毒具有基因組容量大及非必需區(qū)基因多的特點，有利于進行基因工程操作，易于構建和分離重組病毒。它還可以插入多個外源基因，并對插入的外源基因有較高的表達水平。腺病毒容易增殖、使用方便、穩(wěn)定性良好，具有廣泛的免疫適應性，既可以在呼吸道增殖，也可以在消化道增殖，因此具備作為活病毒口服疫苗載體的條件。兩種重組病毒不需佐劑即可免疫動物，成為基因重組疫苗研究的有效工具。
BrittonP和TorresJM等將S基因插入到痘病毒和腺病毒載體中，然后用這兩種重組的痘病毒和腺病毒免疫動物，均可誘發(fā)抗TGEVS蛋白的中和抗體。
唐芳等將S蛋白基因5'端包含B、C抗原位點的1.0kbDNA片段，并與穿梭載體pShuttle-CMV連接；然后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183，通過同源重組獲得重組腺病毒質粒。該重組腺病毒質粒轉染HEK293細胞并進行噬斑純化，獲得了1株含有TGEVS蛋白5’端基因的重組人復制缺陷型血清5型腺病毒。細胞連續(xù)傳代9次后，病毒效價穩(wěn)定。動物免疫試驗顯示，重組病毒可以誘導小鼠產生TGEV特異性IgG和IgA。
