顧江萍 上海交通大學
冠狀病毒轉錄主要來自于畜牧研究人員對DI-RNAs的研究，包括TGEV包裝信號的定位、S基因在TGEV中發(fā)揮的作用等，但是利用DI-RNAs得到的病毒基本生命過程的研究結果不一定總是使用病毒全長基因組，例如病毒的復制酶結構功能分析研究存在矛盾之處。用全長感染性構建物拯救出病毒來研究病毒的復制表達調控機制會更符合病毒的生命過程。這表明TGEV感染性構建物的研究在TGEV生物學研究和致病性機制探索的方面越來越實用。
感染性克隆技術為從分子水平上研究冠狀病毒基因的結構和功能，病毒的致病機理提供了技術支持，也為開發(fā)嵌合疫苗、減毒疫苗、基因亞單位疫苗以及改造病毒基因組，構建新型病毒載體奠定了基礎。冠狀病毒基因組較大，構建全長克隆必須用大容量的載體，加之cDNA克隆在菌體內的不穩(wěn)定性使構建基因組全長cDNA克隆十分困難。所以有些研究避開這兩方面的問題，只以能夠獲得病毒感染性RNA為最終目的，即先利用RT-PCR技術擴增出覆蓋基因組全長的幾個cDNA片段，然后利用引入的定向插入位點將其進行體外連接獲得基因組全長cDNA后，直接轉錄獲得病毒RNA或者先構建出亞克隆，再在體外將其拼接成全長cDNA分子，直接進行轉錄獲得感染性轉錄體。借助感染性克隆在體外對病毒的基因組進行基因敲除、定點誘變等人工操作，可深入了解病毒生命過程中各種基因的調控作用，進一步研究冠狀病毒的致病分子機理。以感染性克隆為工具通過基因缺失、基因置換等手段還可以有效地確定病毒的關鍵毒力位點，從而為開發(fā)減毒疫苗提供理論支持。也可以利用基因嵌合技術將不同病毒保護性抗原基因進行嵌合，為多價疫苗的研制奠定理論基礎。
設計抗病毒藥物干擾冠狀病毒復制是一個合理的方法，這需要在分子水平詳細研究其復制機制，冠狀病毒來源的復制子是選擇有效干擾因子的有用工具，TGEV的復制機制的揭密必然會帶動包括SRAS病毒在內的一系列冠狀病毒的研究。Almazan等在以BAC為載體的TGEV感染性cDNA克隆的基礎上構建TGEV基因缺失復制子，結果在缺失N基因的復制子轉染的細胞中檢測不到轉錄,說明N蛋白在復制活性中的可能角色。以上對基因進行缺失的手段推動了病毒致弱的分子機制的研究，提供產(chǎn)生減毒重組TGEV的有效方法。Ortego等通過反向遺傳技術研究了E基因的功能，他們構建了缺失E基因的重組TGEV(rTGEV-ΔE)，該缺失突變體只能在表達E蛋白的細胞中生長，電鏡顯示rTGEV-ΔE感染BHK-pAPN-E-cells后，只有不成熟的細胞內病毒粒子組裝。
這些病毒粒子沒有感染性，不能分泌到細胞外的培養(yǎng)液中。RNA和蛋白組成分析顯示rTGEV-ΔE病毒粒子含有RNA和除E蛋白以外的TGEV所有蛋白，共聚焦和免疫電鏡顯示由于缺乏E蛋白，病毒在分泌途徑中的中間運輸過程和完整病毒的成熟過程被阻止。Galan等用TGEV全長和2個TGEV來源的微基因組開展病毒拯救進行TGEV基因組的637位堿基(位于ORF1a內)的位點突變分析，發(fā)現(xiàn)兩者拯救病毒需要不同的核苷酸。位點突變導致的不同病毒拯救效率提示兩種拯救方式病毒的復制機制的差異，也進一步說明用全長cDNA克隆研究病毒復制機制的必要。另外，冠狀病毒作為分子克隆的表達載體有幾個比其他病毒病毒載體優(yōu)越的地方：
①單股RNA病毒在細胞漿內復制，沒有DNA中間體存在，因而不可能整合到宿主細胞染色體中去。
②這些病毒基因組大，從理論上講可以容納較大的外源基因。
③冠狀病毒一般感染黏膜表面,呼吸道和腸，能誘導產(chǎn)生強烈的黏膜免疫反應。
④冠狀病毒的組織嗜性可能通過改變S蛋白基因而改變。
⑤存在感染許多種屬動物(人、豬、犬、貓)的非病原性的冠狀病毒株，可用于開發(fā)不同表達系統(tǒng)。
⑥已建立感染性的DNA克隆，可用于表達載體構建。
⑦多順反子基因組結構和sgmRNAs的合成可能允許多個外源基因的同時表達。
⑧與動脈炎病毒表達載體相反,冠狀病毒基因間序列很少與上游ORFs重疊，使表達外源基因方便。
⑨TGEV下游的幾個ORFs能從病毒基因組去掉而不會影響病毒體外感染性。
SolaI等將BAC作載體的TGEV感染性cDNA克隆改造成一個表達載體，此載體可在ORF3處插入外源基因，0.72kb的綠熒光蛋白GFP基因通過取代非必需的3a和3b基因而克隆RNA基因組(保留ORF3a的TRS)，異源熒光蛋白可穩(wěn)定、高效地表達，且人工載體的表達水平同其他載體的表達水平一樣高。雖然含有GFP的重組TGEV對腸道仍有致病作用，但其在腸組織中的生長速度降低了10倍～100倍。
其可誘導產(chǎn)生針對TGEV和GFP誘導特異性的乳源免疫反應,母豬及其所產(chǎn)仔豬對異源蛋白有特異性促乳免疫反應，對仔豬提供黏膜感染的保護作用，這均顯示出TGEV感染性克隆作為黏膜免疫疫苗載體的潛力，因而TGEV將作為一種活病毒載體在豬病的預防中發(fā)揮重要作用。
但作為載體還要考慮安全問題，Curtis等在TGEV感染性構建物的基礎上，構建了缺乏ORF3b、E或ORF3b、E、M基因的復制子(復制子分別命名為TGEVRep(AvrⅡ、TGEVRep(EcoNⅠ)），因為E和M蛋白是TGEV出芽所必需，所以這些RNAs復制子應能復制但不能導致感染性病毒的產(chǎn)生。為準備能組裝TGEV復制粒子(TGEVVRP)的包裝系統(tǒng),將TGEVE基因克隆進委內瑞拉馬腦炎(VEE)復制子表達載體中,分離編碼TGEVE基因的VEE復制粒子。將TGEVRep(AvrⅡ)與VEE-TGEV(E)RNA轉錄子共轉染BHK細胞，或在TGEVRep(AvrⅡ)轉染后，再感染攜帶TGEVE基因的VEE病毒復制粒子(VRPs)，2種情況下都能在感染細胞中檢測到GFP的表達和轉錄子。由于缺乏子代病毒釋放，另外在TGEV復制子包裝系統(tǒng)中涉及一個不相關載體的運用，使復制子和輔助RNAs間的重組事件發(fā)生的可能性減少,所以該表達系統(tǒng)比減毒活疫苗安全。
