顧江萍 上海交通大學(xué)
全長(zhǎng)cDNA感染性克隆技術(shù)也稱反向遺傳學(xué)技術(shù)，它是指獸醫(yī)由病毒的cDNA克隆獲取RNA病毒的一項(xiàng)技術(shù)，包括病毒基因組全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建技術(shù)和由質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄病毒RNA的感染性轉(zhuǎn)錄體制備技術(shù)。冠狀病毒是已知RNA病毒中基因組最大的一類病毒，其基因組復(fù)制不涉及DNA中間體，所以要進(jìn)行病毒分子水平上的研究，必須將病毒基因組RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，然后構(gòu)建出cDNA克隆，通過(guò)對(duì)cDNA克隆的操作間接實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因組RNA的操作，從而為冠狀病毒基因組研究提供易于操作的技術(shù)平臺(tái)，大大提高了病毒的研究潛力。冠狀病毒基因組片段太大，同時(shí)cDNA克隆在宿主細(xì)胞不穩(wěn)定等因素一直制約著冠狀病毒全長(zhǎng)基因組反向遺傳系統(tǒng)的建立。
近年來(lái)，冠狀病毒的反向遺傳技術(shù)有了突破，國(guó)外已成功構(gòu)建出數(shù)種冠狀病毒全長(zhǎng)cDNA克隆，對(duì)TGEV已有數(shù)篇報(bào)道。其原理是在獲得冠狀病毒基因組全長(zhǎng)cDNA后，通過(guò)體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得感染性轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后產(chǎn)生有感染性的病毒粒子。通過(guò)對(duì)病毒基因修飾后拯救出的病毒與野生型病毒表型的比較，可用來(lái)研究病毒在生命周期中病毒特性和致病機(jī)理,也對(duì)尋找新型疫苗進(jìn)行病毒病的防治和基因治療等方面提供理論支持。而國(guó)內(nèi)對(duì)反向遺傳研究相對(duì)起步較晚，尤其是TGEV感染性克隆，有部分初步研究探索的文章，但尚未見(jiàn)成功構(gòu)建的研究報(bào)道。
Almazan等在構(gòu)建豬傳染性胃腸炎病毒全長(zhǎng)cDNA時(shí)，用該病毒的一株缺陷RNA毒株(DIC)。此缺陷毒株基因組大小為9.7kb，它在低拷貝和高拷貝質(zhì)粒載體中都可穩(wěn)定存在，DICRNA相對(duì)TGEV完整基因組有三個(gè)缺失序列，分別位于基因組的ORF1a、ORFlb和結(jié)構(gòu)基因中。他們將這三個(gè)缺失用TGEVPUR—MAD株的基因序列按一定先后順序填補(bǔ)完整，然后將全長(zhǎng)cDNA分子克隆到細(xì)菌人工染色體(Bacterialartificialchromosome，BAC)中，用2步擴(kuò)增系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染進(jìn)ST細(xì)胞的cDNA首先在cDNA克隆自帶的CMVIE啟動(dòng)子下在細(xì)胞核內(nèi)被細(xì)胞RNApolⅡ所轉(zhuǎn)錄，第2步擴(kuò)增在胞漿內(nèi)為病毒多聚酶所驅(qū)動(dòng)。這樣得到的PUR-MAD株全長(zhǎng)cDNA克隆保留了引入的所有遺傳標(biāo)記，合成的病毒具有預(yù)期的抗原特性。
系統(tǒng)性體外裝配是組建TGEV全長(zhǎng)感染性構(gòu)建物的又一方法。利用一些獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為各段cDNA克隆的接頭，這些接頭序列是基因組本身攜帶或通過(guò)在PCR引物中進(jìn)行沉默突變而巧妙引入，使得毗鄰cDNA亞克隆間精確組裝，病毒基因?qū)?xì)菌毒性問(wèn)題通過(guò)對(duì)該區(qū)分段克隆也得以解決，導(dǎo)致TGEV全長(zhǎng)cDNA產(chǎn)生，體外轉(zhuǎn)錄是有感染性的，其空斑純化病毒與野生型TGEV具相同的空斑形態(tài)及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。
Youn等嘗試分段克隆，利用亞克隆體外連接與直接轉(zhuǎn)錄的方法產(chǎn)生RNA，用RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救病毒，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、直接，避免了不穩(wěn)定克隆的出現(xiàn)，他們還發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染表達(dá)TGEV-N基因的質(zhì)粒可提高TGEV的感染力，說(shuō)明N基因有反式激活作用，該方法設(shè)計(jì)主要是利用一些特殊的限制性內(nèi)切酶作為各個(gè)cDNA克隆的接頭，這些接頭序列可通過(guò)誘變PCR方法進(jìn)行沉默突變而巧妙地引入，又不影響病毒本身編碼序列。這種系統(tǒng)性體外裝配方法可進(jìn)一步運(yùn)用到微生物(如細(xì)菌、真菌)全長(zhǎng)基因組甚至高等生物基因組的合成。然而，這種方法雖然操作步驟簡(jiǎn)單，但難度很大，主要表現(xiàn)之一就是基因組亞克隆片斷的體外拼接。
