顧江萍 上海交通大學(xué)
1RT-PCR
Woods等建立了TGEV的RT-PCR檢測(cè)技術(shù),結(jié)果證實(shí)RT-PCR是一種特異、敏感的診斷方法。國(guó)內(nèi)李軍等建立了檢測(cè)TGEV的RT-PCR方法，用此RT-PCR方法檢測(cè)56份豬腹瀉糞樣,同時(shí)用夾心ELISA法作對(duì)照。結(jié)果顯示,RT-PCR法檢測(cè)的20份陽(yáng)性糞樣，用夾心ELISA法檢測(cè)有14份呈陽(yáng)性兩者的符合率為89%。試驗(yàn)結(jié)果表明，RT-PCR法可檢出lpg的TGEVRNA，比夾心ELISA法敏感性更高,說(shuō)明RT-PCR方法可用于TGEV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。PatonD和IbataG改進(jìn)了RT-PCR，用來(lái)擴(kuò)增TGEV和PRCVS基因5'端序列，區(qū)分二者是通過(guò)PCR產(chǎn)物的片段大小,該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了26種TGEV和PRCV分離株病毒核酸的RNA。根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果與預(yù)測(cè)的核酸分子量大小相比較,可以判定樣品中是否有TGEV的存在。這種方法較較之已知的傳統(tǒng)的血清學(xué)和免疫學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)在于可以免去病毒分離過(guò)程,快速準(zhǔn)確，有較高的特異性和敏感性。
2多重RT-PCR
多重PCR法是采用多對(duì)引物,在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增多種靶序列。多重PCR鑒定的優(yōu)點(diǎn)是可以快速的鑒別診斷兩種以上的病毒，并將PCR的敏感性和快速性結(jié)合起來(lái)，而且避免了逐一分離每個(gè)待測(cè)樣品中病毒的麻煩。KimO和ChoiC用改進(jìn)的多重RT-PCR方法來(lái)區(qū)分PEDV和TGEV，以半數(shù)致死量的TGEV和PEDV經(jīng)人工感染3日齡仔豬后取病變組織，提取病毒RNA，以此為模板,以TGEV和PEDV的兩對(duì)基因引物進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)RT-PCR的產(chǎn)物片段大小與預(yù)測(cè)DNA片段大小相比較。該方法的難點(diǎn)在引物設(shè)計(jì)上，要求引物具有特異性。另外引物設(shè)計(jì)的越多，發(fā)生引物二聚體的幾率就越大，還可造成與模板非特異性的結(jié)合，影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。多重RT-PCR方法多用來(lái)在一種組織中同時(shí)鑒別多種病毒，但這種方法一般適用于一種核酸類型的病毒。
3套式RT-PCR
套式RT-PCR方法專門應(yīng)用于鑒別TGEV和PRCV，因PRCV在S基因5'區(qū)上有一個(gè)比較大的缺失區(qū)，在基因3'3a和基因3'3b上有一個(gè)小的缺失區(qū)，缺失區(qū)的大小因分離株的不同而有所差別，如PRCV的Europe和US株。PRCV具有呼吸道組織嗜性，溫和的亞臨床呼吸道感染狀態(tài)，傳統(tǒng)檢測(cè)抗原的診斷方法不能區(qū)分二者，阻斷ELISA方法也只是在疾病發(fā)生一段時(shí)間后進(jìn)行。KimL和ChangKO建立了一種將套式PCR與RT-PCR相結(jié)合的方法，該法是針對(duì)二者S基因部分序列的差異性而設(shè)計(jì)出來(lái)的。反轉(zhuǎn)錄體系引物是針對(duì)于PRCV的S基因缺失區(qū)而設(shè)計(jì)，上游引物和下游引物恰好位于PRCVS基因缺失區(qū)兩端。這樣對(duì)樣品進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)結(jié)果是：如果有TGEV的存在，那么產(chǎn)物應(yīng)為陽(yáng)性，在電泳的泳道上可觀察到與預(yù)先設(shè)計(jì)一樣大小的DNA片段；反之，則為陰性。
4核酸探針雜交技術(shù)
核酸探針是將特定標(biāo)記物通過(guò)隨機(jī)引物法、PCR法、缺口平移法等標(biāo)記到某段特定的核苷酸上，與待檢核酸樣品在一定的支持物上進(jìn)行雜交，然后通過(guò)一定顯示系統(tǒng)來(lái)探查靶核酸的一種特異性檢測(cè)方法。目前，己建立了用核酸探針雜交技術(shù)檢測(cè)糞便樣品、感染組織或感染細(xì)胞中的TGEV，用這些探針可區(qū)別不同TGEV毒株。
5放射性探針膜雜交
TGEV為單股正鏈RNA病毒，根據(jù)將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的一段cDNA用放射性同位素標(biāo)記后與病毒的mRNA可發(fā)生特異性結(jié)合的原理，ShockleyLJ和KapkePA首先克隆長(zhǎng)為2000個(gè)堿基的cDNA探針來(lái)診斷TGEV。而后Benfield和Jackwood建立了用核酸探針檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物和樣品中TGEV的斑點(diǎn)雜交(DotBlot)法。他們應(yīng)用放射性同位素32P對(duì)五種不同的cDNA探針進(jìn)行標(biāo)記這五個(gè)探針?lè)謩e是位于TGEV核酸S基因5'端的HP1600、PD24、PE21和位于3'端非編碼序列的PA2、PB4。其中5'端的探針PD24可以用來(lái)區(qū)分冠狀病毒屬的不同成員，如CCV、FIPV、PRCV，最小檢出量為20~200ng。
6放射性標(biāo)記探針原位雜交
1996年SirinarumitrT和PaulPS使用了含有TGEVS基因部分序列的兩種質(zhì)粒，分別為pPSP.FP1和pPSP.FP2，將其制備成放射性35SRNA探針?lè)謩e檢測(cè)了接種于細(xì)胞培養(yǎng)物上和自然感染病變肺臟組織中的TGEV和PRCV。發(fā)現(xiàn)TGEV的RNA主要存在于腸道上皮絨毛頂部,較少一部分存在于隱窩上皮細(xì)胞中，而PRCV主要在呼吸道上皮細(xì)胞中復(fù)制，較少一部分在型肺泡細(xì)胞型肺泡細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中增殖，這項(xiàng)研究證明原位雜交在區(qū)分組織中的TGEV和PRCV時(shí)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。盡管原位雜交是一種比較有效的檢測(cè)工具，但卻存在著費(fèi)時(shí)的弊端。
7非放射性探針原位雜交
放射性同位素標(biāo)記的核酸探針優(yōu)點(diǎn)是靈敏性極高、雜交的結(jié)果很干凈、清晰。但對(duì)環(huán)境污染和對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員具有強(qiáng)烈的傷害，限制了它在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。近年來(lái)，非放射性標(biāo)記物如熒光素、生物素、地高辛等標(biāo)記的核酸探針被廣泛的應(yīng)用到TGEV分子生物學(xué)的研究中，其中對(duì)地高辛標(biāo)記的TGEV核酸探針研究得更為廣泛和深入。這種檢測(cè)技術(shù)具有特異性、準(zhǔn)確可靠、速度快、安全、對(duì)環(huán)境及人體無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，其標(biāo)記物可反復(fù)使用不存在半衰期的問(wèn)題。其標(biāo)記的核酸探針在50%甘油于-20℃可保存半年之久,被廣泛用于基因定位、診斷、序列分析、核酸的轉(zhuǎn)移、克隆。2001年KimB和ChaeC采用了非放射性地高辛標(biāo)記的cDNA探針與TGEV的核衣殼蛋白基因進(jìn)行雜交，并與傳統(tǒng)的病毒分離(IV)、熒光抗體實(shí)驗(yàn)(FAT)、掃描電鏡(TEM)等方法作了比較,探針的檢出率最高為81%。該法與傳統(tǒng)的VI、FAT、TEM相比其特異性較高，而且不用分離病毒可快速進(jìn)行組織學(xué)診斷TGEV。原位組織雜交技術(shù)不但可檢測(cè)到TGEV同時(shí)還可提供被感染細(xì)胞的信息，TGEV主要存在于成熟的有吸收性的腸上皮細(xì)胞組織中，而隱窩的上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了TGEV，但是量少。
綜上所述，近年來(lái)獸醫(yī)診斷TGEV的診斷技術(shù)進(jìn)展顯著，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為診斷TGEV提供了強(qiáng)有力的手段，成為今后診斷技術(shù)的發(fā)展方向。同時(shí)傳統(tǒng)診斷方法如病毒分離和鑒定、電鏡技術(shù)等，其診斷價(jià)值不能忽略。在實(shí)際工作中,我們只有將傳統(tǒng)的診斷方法與新型的分子生物學(xué)診斷方法結(jié)合起來(lái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，才能取得滿意的效果。
