顧江萍 上海交通大學(xué)
獸醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)豬傳染性腸胃炎病毒（TGEV）由4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。纖突(S)蛋白為糖蛋白，形成病毒突起；膜(M)蛋白主要包埋在脂質(zhì)囊膜中；核衣殼(N)蛋白包裹著基因組RNA；sM蛋白是與膜相關(guān)的蛋白，這4種結(jié)構(gòu)蛋白及其在病毒粒子中的功能各有其特點(diǎn)。
1.S蛋白
S蛋白位于病毒的最外面，形成典型的花瓣?duì)钅夷ね黄穑L(zhǎng)20nm，突出于病毒粒子表面。成熟蛋白分子量約200KD。編碼S蛋白的S基因全長(zhǎng)約4.35×103bp，最初合成的S蛋白前體由1447或1449個(gè)氨基酸殘基組成，N端含有16個(gè)氨基酸組成的短鏈?zhǔn)杷蛄?，起分泌信?hào)肽的作用，S蛋白前體經(jīng)切除信號(hào)膚和終末糖基化而成熟，形成穩(wěn)定的三聚體，裝配到病毒顆粒上。目前研究資料表明，S糖蛋白具有以下幾個(gè)方面的功能：
①攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。
②含有宿主細(xì)胞氨基肽酶(AminopeptidaseN，APN)的受體識(shí)別位點(diǎn)，決定其宿主組織細(xì)胞親嗜性。
③決定TGEV的毒力。
④具有細(xì)胞膜融合作用，協(xié)助細(xì)胞核蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿。
⑤具有血凝活性區(qū)，用唾液酸酶處理TGEV可激發(fā)血凝活性，但此區(qū)域在PRCVS蛋白中缺失，因此檢測(cè)血凝活性的存在與否是一種區(qū)分PRCV和TGEV的方法。
通過單克隆抗體中和試驗(yàn)確定S蛋白存在3個(gè)層次的抗原結(jié)構(gòu)，即抗原位點(diǎn)、抗原亞位點(diǎn)和抗原決定簇，S蛋白有4個(gè)主要抗原位點(diǎn)A、B、C、D，包含于S基因二分之一的氨基端的543個(gè)氨基酸殘基內(nèi)，由S基因5'端僅占2.2kb的基因片段編碼。研究表明，TGEV的不同分離株之間的4個(gè)抗原位點(diǎn)的位置稍有差異，A、B和D位點(diǎn)高度保守，而C位點(diǎn)稍有變化。A位點(diǎn)在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體中起關(guān)鍵作用，此位點(diǎn)的缺失可導(dǎo)致S蛋白不產(chǎn)生中和抗體，A、B兩抗原位點(diǎn)是依賴于S蛋白的糖化作用和正確折疊構(gòu)型產(chǎn)生的，而C、D兩抗原位點(diǎn)的這種依賴性則很小。抗原位點(diǎn)B位于97-144位氨基酸范圍內(nèi)，至少有三個(gè)抗原表位組成，第97位和第114位氨基酸對(duì)B位點(diǎn)的形成起決定性作用。C位點(diǎn)不暴露于病毒粒子的表面，是連續(xù)的線性結(jié)構(gòu)，C位點(diǎn)是第50和51位的氨基酸殘基，可用48-P/S-P-N-S-D-52表示，位于S蛋白氨基端的48-52位氨基酸內(nèi)。D位點(diǎn)大約在378-395氨基酸范圍內(nèi)，至少包含兩個(gè)抗原表位，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要位點(diǎn)，第385位氨基酸殘基(Gly)在D位點(diǎn)中構(gòu)成重要的抗原表位，體外試驗(yàn)證明，A、D位點(diǎn)在誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體中起重要作用，若S基因中缺失A、D位點(diǎn)序列，其表達(dá)產(chǎn)物不能產(chǎn)生中和抗體。
2.N蛋白
N蛋白是一種磷酸化的酸性蛋白，以核糖核蛋白復(fù)合體的形式于病毒粒子的內(nèi)部，以螺旋式結(jié)構(gòu)圍繞RNA，直徑9-15nm，使其易摻入病毒粒子中。N基因?yàn)?.7xl03bp，分子質(zhì)量約為45KD，翻譯產(chǎn)物為382個(gè)氨基酸殘基。N蛋白具有高度保守三個(gè)抗原區(qū)域(A、B、C)，但PRCV在B區(qū)域與TGEV有差異。N蛋白通過對(duì)自身蛋白水解位點(diǎn)的水解及去磷酸化作用，對(duì)病毒粒子的裝配起重要影響。
3.M蛋白
M蛋白是一種N端被糖基化的完整膜蛋白，是構(gòu)成病毒粒子不可缺少的必需成分。M基因大小2.6×103bp，M蛋白初級(jí)翻譯產(chǎn)物為262個(gè)氨基酸殘基，是一種轉(zhuǎn)膜蛋白，轉(zhuǎn)位于膜上前通過切掉17個(gè)氨基酸殘基的N末端信號(hào)膚成為成熟M蛋白，分子質(zhì)量為29.5KD，攜帶一條富含甘露糖天冬氨酞(Asn)連接的側(cè)鏈，而不成熟型M蛋白的分子質(zhì)量高達(dá)36KD，并具有更復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)。M蛋白影響病毒的變異，決定了冠狀病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的裝配位點(diǎn)，同時(shí)具有穩(wěn)定病毒核心區(qū)域的作用。
通過對(duì)M蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白氨基酸序列可以分為以下幾個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，從N端到C端依次為信號(hào)膚、膜外區(qū)、跨膜區(qū)、極性區(qū)及突于病毒粒子內(nèi)C一端區(qū)(或突出于囊膜外區(qū))的五個(gè)功能域，即M蛋白在病毒囊膜中經(jīng)過多次跨膜。RasschaertD等研究認(rèn)為N端去除信號(hào)肽后，還有1個(gè)約40個(gè)氨基酸殘基的高度親水區(qū)，其中含有糖基化位點(diǎn)，構(gòu)成M蛋白的外區(qū)，含4個(gè)半胱氨酸殘基;緊接著是3個(gè)疏水的膜鑲嵌片段，兩性區(qū)及親水的C端位于病毒粒子的內(nèi)部。TGEV感染的仔豬血液和腸道中有高水平的IFN-α，TGEV感染誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生和M蛋白。用M蛋白制備的特異性單克隆抗體能有效地阻斷IFN-α干擾素的合成，而S、N蛋白的特異性單克隆抗體則無(wú)此作用，對(duì)突變的M基因的序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)相關(guān)氨基酸殘基都位于最后22個(gè)N末端殘基內(nèi)，并表明誘導(dǎo)干擾素的區(qū)域位于M蛋白的外部區(qū)域，主要起著效應(yīng)器的作用。
4.sM蛋白
sM結(jié)構(gòu)蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種小囊膜蛋白，基因大小為249bp，由82個(gè)氨基酸殘基組成，在每個(gè)病毒粒子中含有約20個(gè)拷貝數(shù)。通過多肽掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)殘基64-AYKNF-68是誘生抗sM單克隆抗體的核心序列。sM的抗原位點(diǎn)位于C末端，在TGEV感染的豬血清中能檢出抗sM的抗體。sM在抗TGEV感染的體液免疫和細(xì)胞免疫中的功能作用還須進(jìn)一步研究。推測(cè)sM是TGEV有效復(fù)制的必需成分，在調(diào)控病毒粒子的裝配以及釋放中起重要作用。
