張靜 上海交通大學
溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-released protein, MRP）又稱類M蛋白，由1256個氨基酸組成，大小為136kDa。MRP存在于細胞表面，與SS2的粘附作用有關，是SS2的一種重要的毒力因子，具有良好的免疫原性，是良好的保護性抗原，可作為亞單位疫苗候選蛋白。MRP完整基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達量相當?shù)?，可能與高水平表達MRP對宿主菌有毒性作用有關。
1989年Signas C等畜牧研究人員對MRP的619至985位氨基酸的片段進行克隆表達，發(fā)現(xiàn)與金黃色葡萄球菌的纖維素結合蛋白的功能很相似。2002年國內(nèi)歐瑜等首次克隆表達了SS2江蘇分離株HA9801mrp基因750-1634bp的片段，免疫印跡分析，表達蛋白表面有MRP抗體結合表位。2004年范紅結等克隆了SS2 HA9801株mrp基因的298-827bp間529bp片段，表達大小為42kDa的重組蛋白，表達蛋白經(jīng)QIAgen鎳親和層析柱層析純化，以含20ug、40ug、80ug純化蛋白的劑量分組混合弗氏完全佐劑首免和不完全佐劑二免后，以5LD50SS2-D菌株攻擊，BALB/c小鼠的相對存活率分別達到62.5%、62.5%、50%，表明所表達的蛋白具有保護性抗原的功能，提示該片段可能為MRP重要的功能區(qū)。
2008年李耿等利用表達載體pGEX-3X表達了MRP的功能性片段，大小為73kDa的重組蛋白經(jīng)谷胱甘肽親和層析純化，以50 ug純化蛋白免疫BALB/c小鼠，首次免疫加等量弗氏完全佐劑，2周后加等量弗氏不完全佐劑進行第2次免疫，10d后以5LD50SS2 CVCC606攻擊BALB/c小鼠，可產(chǎn)生60%的免疫保護率，生理鹽水對照組小鼠則全部死亡。
SS2胞外因子(Extracellular protein facter, EF)的分子量為110kDa，僅能從培養(yǎng)物上清液中檢出，為細胞外蛋白，是SS2的一種重要的毒力因子。對EF的epf基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其存在三個開放閱讀框。根據(jù)對從荷蘭分離到的180株SS2菌株的MRP與EF分析發(fā)現(xiàn)，從病豬體內(nèi)分離的菌株有80%為MRP+EF+表現(xiàn)型，從健康豬扁桃體中分離的菌株該表現(xiàn)型占2%，86%表現(xiàn)為MRP－EF。
2001年WisselinkHJ等對SS2毒力因子MRP及EF這兩種的免疫保護作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)以親和層析法提純的MRP或EF單獨免疫豬，對的保護率低于將兩種提純蛋白混合免疫組及MRP和EF陽性的菌株全菌滅活疫苗組，但臨床癥狀比對照組顯著減輕，研究還發(fā)現(xiàn)，采用油包水(a water-in-oil emulsion, W/O)的效果優(yōu)于鋁膠(aluminiumhydroxide-based adjuvant, AH)，前者可以提高抗體滴度。2003年歐瑜擴增SS2HA98011207-1675bp序列，表達的42 kDa融合蛋白不能被EF抗血清識別，表明抗原表位不在該區(qū)。2005年李明等擴增了豬鏈球菌2型江蘇分離株SS2-1 epf基因1783-2563位，連接pET-32a表達大小為47kD的蛋白，免疫轉印結果發(fā)現(xiàn)該蛋白可與其抗血清發(fā)生作用，表達蛋白具有免疫原性，顯示該片段為EF的主要功能區(qū)。同時研究表達蛋白EF對新西蘭兔的免疫保護率，免疫5只新西蘭兔，最小致死量SS2-1攻擊，5只兔全部死亡，MRP免疫組1/4獲得保護，SS2-1全菌滅活苗組獲得100%保護。
