輪狀病毒（Rotaviruses,RVs）中的A群、B群和C群已經(jīng)被確認(rèn)為是豬腹瀉的重要病原，其中A群輪狀病毒是豬群中最常見(jiàn)的引起腹瀉性疾病的主要病原。幼齡仔豬最為易感，1～4周齡仔豬發(fā)病率超過(guò)80%，死亡率達(dá)7% ～20%，癥狀也較嚴(yán)重。同時(shí)，由于該病常與其他疾病混合感染，使病情加重，導(dǎo)致死亡率增高，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究根據(jù)豬A群輪狀病毒的NSP4基因建立了一步法RT-PCR檢測(cè)方法，為豬A群輪狀病毒病的檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

    1、材料

    1.1、樣品

    豬A群輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流感病毒；豬瘟病毒活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗。

    1.2、主要試劑

    TRIzol® Reagent提取試劑盒、Prime ScriptTM one Step RT-RCR kit Ver.2試劑盒、DL-2000 Marker、溴化乙錠。

    1.3、引物

    根據(jù)GenBank上登錄的豬A群輪狀病毒的NSP4基因（登錄號(hào)為KU363142.1）序列利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)特異性引物。引物序列F：5＇-GTGCGGAAAGATGGATAA-3＇；R：5＇-CATTCGCTGGATTGGTTA-3＇。擴(kuò)增目的片段大小為683 bp。

    2、方法

    2.1、RNA模板的制備

    取250 μL的樣品加入750 μL TRIzol中，顛倒混勻后室溫靜置3～5 min；再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混合15 s（也可以用手反復(fù)顛倒混勻），4 ℃下13 000 r/min 離心15 min；小心吸取約500 μL上清液轉(zhuǎn)移至500 μL異丙醇中，顛倒混勻，室溫下靜置15 min，4 ℃下1 300 r/min 離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%的DEPC乙醇，4 ℃下13 000 r/min離心10 min，洗滌2次，干燥后用20 μL DEPC水溶解沉淀，－20 ℃保存，備用。

    2.2、一步法RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

    采用50 μL反應(yīng)體系，通過(guò)對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序的優(yōu)化，確定RT-PCR反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 25 μL，RNase Free H2O 20 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，模板2 μL。

    反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，94 ℃預(yù)變性90 s；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠）電泳檢測(cè)，然后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

    2.3、特異性試驗(yàn)

    利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)ωiA群輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立無(wú)模板陰性對(duì)照。

    2.4、敏感性試驗(yàn)

    利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，將豬A群輪狀病毒的RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋至1×10-5，即濃度分別為13 170，1 317，131.7，13.17，1.317，0.131 7 pg/μＬ，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)該方法的敏感性。

    2.5、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

    利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，分3次提取豬A群輪狀病毒的RNA，并平行進(jìn)行3次RT-PCR擴(kuò)增。

    2.6、臨床應(yīng)用

    應(yīng)用建立的豬A群輪狀病毒一步法RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)模板陰性對(duì)照。并選取14份豬A群輪狀病毒擴(kuò)增陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定，并與NCBI上基因庫(kù)進(jìn)行序列同源性比較。

    3、結(jié)果與分析

    3.1、擴(kuò)增結(jié)果

    提取豬A群輪狀病毒的RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示RT-PCR可擴(kuò)增出NSP4基因的目的條帶，無(wú)模板陰性對(duì)照無(wú)目的條帶。  

    3.2、特異性試驗(yàn)結(jié)果

    利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)ωiA群輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示僅以豬A群輪狀病毒的RNA為模板時(shí)能擴(kuò)增出特異性目的條帶。表明該方法具有較高的特異性，與其他病原無(wú)交叉反應(yīng)。

    3.3、敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    將豬A群輪狀病毒的RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋至1×10-5，進(jìn)行PCR檢測(cè)電泳檢測(cè)結(jié)果顯示最低可以檢測(cè)到的濃度為13.17 pg/μＬ。

    3.4、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    3次平行RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

    3.5、臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

    應(yīng)用建立的豬A群輪狀病毒一步法RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)30份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果樣品陽(yáng)性率為90%（27/30）。同時(shí)選取14份豬A群輪狀病毒擴(kuò)增陽(yáng)性樣品進(jìn)行序列測(cè)定，應(yīng)用在線軟件進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)定序列與GenBank中的其他豬A群輪狀病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。表明本試驗(yàn)建立的豬A群輪狀病毒一步法RT-PCR檢測(cè)方法能夠成功地用于臨床樣品的檢測(cè)。

    4、討論

    動(dòng)物疫病及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷是有效控制疫病蔓延的關(guān)鍵。隨著分子生學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新技術(shù)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷中，其中PCR技術(shù)是各種動(dòng)物疫病診斷技術(shù)中應(yīng)用最成熟的方法之一。本研究建立的豬A群輪狀病毒一步法RT-PCR檢測(cè)方法與一般RT-PCR方法相比，不僅操作簡(jiǎn)便，而且縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。本方法靈敏性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。通過(guò)臨床應(yīng)用表明該方法可對(duì)A群輪狀病毒做出準(zhǔn)確的診斷，可以很好地應(yīng)用于豬A群輪狀病毒病的臨床診斷。

   （趙鳳菊、關(guān)淼、李井春、關(guān)乃鵬、陳瑤、趙曉彤  黑龍江畜牧獸醫(yī)雜志社）