牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CS-FV)以及羊邊界病病毒(borderdiseasevirus，BDV)同屬于黃病毒科(Flaviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，三者存在血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，由它們所引起的傳染病每年給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV宿主范圍較廣，除感染牛外，還可以感染豬、綿羊、山羊、鹿及野生動物。豬感染BVDV后會出現(xiàn)類似慢性豬瘟的臨床癥狀和病理變化。Fernelius等于1973年首次從自然感染發(fā)病的豬體內(nèi)分離出BVDV，證實BVDV能夠引起豬自然感染。國內(nèi)，王新平等于1996年首次從疑似豬瘟病毒感染病料中分離鑒定出BVDV;宋永峰等采用ＲT－PCＲ方法檢測浙江等6個省市的43份豬病料，結(jié)果陽性檢出率為16.3%(7/43);戴益民等對已做過CSFV檢測的52份病料進(jìn)行BVDV回歸性檢測，結(jié)果表明BVDV陽性率分別為10.0%(2004年)、14.3%(2005年)、12.5%(2006年)、15.8%(2007年);吳文輝等對2009—2010年疑似豬瘟病毒感染的287份樣品進(jìn)行BVDV抗原檢測，結(jié)果陽性檢出率達(dá)80.48%(231/287)。表明我國豬群中存在BVDV感染，分布范圍較廣，感染率較高，尤其近幾年來，不斷有BVDV感染并被分離的報道。鑒于CSFV與BVDV之間存在交叉感染的情況，本文對臨床診斷中表現(xiàn)為豬瘟癥狀的病死豬進(jìn)行了臨床和實驗室診斷，最終通過分子生物學(xué)方法和核酸序列鑒定確診該豬場發(fā)生了BVDV感染，現(xiàn)將診斷過程介紹如下。
1發(fā)病情況
2013年春季，青海某種豬場所產(chǎn)仔豬陸續(xù)產(chǎn)有死胎、木乃伊胎，出生仔豬體弱，生長遲緩，腹瀉、消瘦，死亡率不到10%。曾用青霉素、鏈霉素、磺胺類藥物治療，無顯著效果。因懷疑是豬瘟病毒感染，曾用豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)進(jìn)行緊急接種免疫，未能完全控制疫情。
2臨床癥狀
母豬產(chǎn)仔數(shù)量明顯減少，且含有死胎、木乃伊胎，仔豬主要表現(xiàn)厭食，精神萎靡，發(fā)熱，被毛粗亂，腹部皮膚、耳、尾、四肢具有針尖大小的紅色出血點(斑)，腹瀉，消瘦，死亡率不到10%，60日齡后逐漸康復(fù)，但康復(fù)后仍生長緩慢。
3病理變化
剖檢病死豬，可見全身淋巴結(jié)都有不同程度的腫大，切面呈大理石樣，周邊出血，部分豬整個淋巴結(jié)呈血腫，心外膜、腎臟及膀胱黏膜有針尖狀出血點，脾臟邊緣有梗死灶、呈鋸齒狀，胃、結(jié)腸、盲腸黏膜潰瘍，部分可見有多量的紐扣狀潰瘍灶。
4細(xì)菌分離
取無菌采集的病死豬肝、脾、腎組織病料樣品涂片，革蘭氏和瑞氏染色鏡檢，未發(fā)現(xiàn)有任何細(xì)菌。取無菌采集的病死豬肝、脾、腎組織病料樣品分別接種于麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、厭氧肉肝湯中按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定，結(jié)果均無任何細(xì)菌生長。
5分子生物學(xué)檢測
5.1引物的設(shè)計與合成
分別根據(jù)參考文獻(xiàn)分別設(shè)計針對CSFV強毒與弱毒、BVDV特異性檢測引物，引物序列如表1所示，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
5.2樣品的處理與病毒基因組的提取
將采集的肝、脾、腎組織病料樣品混合加入9倍體積的滅菌生理鹽水充分勻漿，反復(fù)凍融3次，10000r/min離心15min，取上清液，按病毒基因組ＲNA提取試劑盒(購自天津博美科生物技術(shù)有限公司)使用說明的操作方法提取組織病料的病毒基因組ＲNA。
5.3ＲT－PCＲ擴(kuò)增與檢測
以提取的病毒基因組ＲNA為模板，參照一步法ＲT－PCＲ試劑盒(購自TaKaＲa公司)使用說明，進(jìn)行CSFV強毒、CSFV弱毒、BVDV的ＲT－PCＲ擴(kuò)增。ＲT－PCＲ反應(yīng)體系為:2×1StepBuffer25μL、StepEnzymeMix2μL、上下游引物P1、P2(或P3、P4或P5、P6)各0.5μL、5μLＲNA、加水至50μL。ＲT－PCＲ擴(kuò)增程序為:50℃1h;94℃4min;94℃45s，57℃45s，72℃45s，30個循環(huán);72℃10min。ＲT－PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，3份臨床組織病料樣品BVDVＲT－PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物在位于154bp大小處均可見特異性DNA條帶，其大小與祖立闖等的報道相符;3份臨床組織病料樣品CSFV強毒ＲT－PCＲ擴(kuò)增均為陰性;3份臨床組織病料樣品CSFV弱毒ＲT－PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物中有1份在位于447bp大小處可見特異性DNA條帶，其大小與李艷等的報道相符，其余2份為陰性。
5.4核酸序列鑒定
將3份臨床組織病料的BVDV和CSFV弱毒ＲT－PCＲ陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果應(yīng)用Blast在線軟件與GenBank中登錄的序列進(jìn)行比較分析表明，3份BVDV陽性ＲT－PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物彼此間序列完全一致，其與GenBank中登錄的BVDV毒株序列(AJ585412)同源性達(dá)99.4%;1份CSFV弱毒ＲT－PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列與GenBank中登錄的CSFV弱毒株序列(AY805221)同源性達(dá)99.6%。
6診斷結(jié)論
經(jīng)豬場發(fā)病情況、臨床癥狀、病理剖檢變化觀察等臨床診斷，以及細(xì)菌分離培養(yǎng)、病毒分子生物學(xué)檢測、核酸序列鑒定等實驗室診斷方法確定，該豬場此次發(fā)病由牛病毒性腹瀉病毒感染所致。
7討論
關(guān)于豬感染BVDV的來源，主要有免疫BVDV污染的豬瘟活疫苗和接觸BVDV感染牛兩種主要途徑。范學(xué)政等用ＲT－PCＲ方法對23批次的豬瘟疫苗進(jìn)行BVDV檢測，結(jié)果顯示，5批次豬瘟疫苗被BVDV污染，污染率達(dá)21.74%;吳文輝等對豬瘟疫苗進(jìn)行BVDV的檢測結(jié)果表明BVDV污染陽性率高達(dá)34.8%。由此得出，豬接種BVDV污染的豬瘟活疫苗是豬感染BVDV的重要來源之一。牛也是引起豬感染BVDV的一個傳染來源，比如接觸了BVDV感染牛羊、采食了BVDV污染的飼料、接觸了BVDV污染過的飼養(yǎng)工具等都可引起感染。有報道在英國某牛場新購進(jìn)牛群與其相鄰豬場的哺乳仔豬同時發(fā)生了病毒血癥，并造成了仔豬死亡，經(jīng)鑒定均為BVDV感染。對于本病例，采用ＲT－PCＲ方法檢測豬場曾經(jīng)免疫的豬瘟活疫苗為BVDV陰性，故排除了豬瘟疫苗帶毒的可能，推測有可能是接觸到了BVDV污染物。
本病例中3份臨床組織樣品經(jīng)CSFV弱毒ＲT－PCＲ檢測2份為陰性，1份為陽性，究其原因，可能是豬感染BVDV產(chǎn)生的抗BVDV抗體對豬瘟病毒有一定的抑制作用，使豬瘟疫苗在體內(nèi)基本不復(fù)制或很少復(fù)制，導(dǎo)致豬體內(nèi)CSFV病毒含量較少或沒有。該結(jié)果與張慧英等和吳文輝等的報道表現(xiàn)出了高度的一致性，張慧英等研究結(jié)果表明BVDV在一定程度上干擾豬瘟疫苗的免疫效果，影響CSFV抗體水平;吳文輝等研究結(jié)果也表明豬場內(nèi)生豬的豬瘟疫苗免疫效果在一定程度上受到BVDV的干擾。
從本病例的診斷中可以得出BVDV可以在豬場發(fā)病，并干擾豬瘟疫苗的免疫效果。在我國目前BVDV流行區(qū)域廣泛的形勢下，將給豬瘟的預(yù)防控制及凈化帶來了新的困難與挑戰(zhàn)。因此，對豬感染BVDV的現(xiàn)狀必須有清醒的認(rèn)識和必要的防控措施，建議加強對豬群中BVDV的監(jiān)測，及時淘汰陽性感染豬，保障畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
(青海省海西州都蘭縣香日德鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，呂建軍)
