馮瑜菲 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
獸醫(yī)發(fā)現(xiàn)致豬水腫病大腸桿菌主要毒力因子為志賀毒素II型變異體和F18ab 菌毛。
1. 志賀毒素Ⅱ型變異體（Stx2e）
1971年，Schmmipfennig提出水腫病可能是由大腸桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素引起的，該毒素類似于志賀氏痢疾桿菌神經(jīng)毒素。1973年，Clugston提出大腸桿菌產(chǎn)生一種血管毒素，并稱之為“水腫因子”（EDP），這種毒素能被硫酸銨沉淀，對熱敏感，溶于堿而不溶于酸。1977年，Konowachuk H等人首次描述了Vero毒素。O’Brien 等報道了腸出血性大腸桿菌（EHEC）產(chǎn)生的志賀毒素，該毒素可以被抗志賀氏毒素的抗毒素中和，對Vero毒素和志賀毒素進行的理化性質(zhì)和免疫原性的比較表明，Vero毒素和志賀毒素是同一種毒素。Scotland 等采用了Vero毒素1（VT1）和Vero毒素2（VT2）這樣的名稱，VT1與SLT-Ⅰ，VT2 與SLT-Ⅱ相互對應(yīng)。
1988年，Cannon用致水腫病大腸桿菌產(chǎn)生的VT毒素對豬靜脈注射，復(fù)制出了水腫病。Macleod DL等將提純的毒素注射到健康仔豬靜脈內(nèi)，可以出現(xiàn)與豬水腫病完全相同的癥狀和損傷，此實驗證明了毒素是水腫病的主要致病因子。此后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)致水腫病大腸桿菌產(chǎn)生的VT毒素與志賀氏菌樣毒素Ⅱ（SLT-Ⅱ）很相似，但又稍有差異，故把它命名為志賀毒素Ⅱ型變異體（Shige-like toxinⅡvariant，SLT-Ⅱv），因為其可致水腫病發(fā)生，現(xiàn)在通常把它稱為Stx2e，該毒素對Vero細(xì)胞具有毒性作用，也可致小鼠死亡，并能引起血管損害而導(dǎo)致水腫。
志賀毒素包括志賀毒素Ⅰ型（Stx1）和志賀毒素Ⅱ型（Stx2）。Stx1的序列高度保守，其與Stx2的同源性僅為58%。Stx1由Stx1A和Stx1B兩個基因編碼產(chǎn)生，與痢疾志賀菌產(chǎn)生的志賀毒素只有一個氨基酸不同，二者具有相同的啟動子。Stx2序列可變，存在幾個亞型，包括Stx2v、Stx2vha、Stx2vhb、Stx2e和Stx2c等，其中Stx2e是引起仔豬水腫病的主要毒力因子，其與Stx2序列高度保守，二者同源性可高達(dá)91%。
Stx2e是由一個A亞基和五個B亞基共同構(gòu)成的聚合體，A、B亞基分子量分別為33.05Ku和7.6Ku，均具有抗原性。編碼Stx2e的特定基因存在于染色體上，Stx2e的結(jié)構(gòu)基因含有兩個開放性閱讀框（ORF），兩個核糖體結(jié)合位點（RBS），兩個信號肽編碼區(qū)及一個終止子結(jié)構(gòu)。其操縱子全長為1980個核苷酸，由兩個亞單位基因組成，即Stx2eA和Stx2eB，兩個亞單位之間有一個15個核苷酸的非翻譯區(qū)。Stx2eA位于242到1199核苷酸處，其中242到307核苷酸片段為前導(dǎo)序列；Stx2eB位于1214到1474bp處，其中1214到1270bp為前導(dǎo)序列。兩個RBS分別位于第228位核苷酸處和1203位核苷酸處，它們分別對Stx2eA和Stx2eB的翻譯進行控制。在Stx2e操縱子中，90~95（-35）和112~117（-10）是調(diào)控序列。在3’端核苷酸第1819~1839處可能是一個轉(zhuǎn)錄終止子。
Stx2e 與 Stx2 基因核苷酸序列之間的同源性可達(dá) 91%，其中 Stx2eA 與 Stx2A 同源性可達(dá)95%，這種同源性可以延伸到 A 亞單位基因上游 200 多個核苷酸，這說明 Stx2e 與 Stx2 具有共同的調(diào)節(jié)機制以及親密的進化親緣關(guān)系。Stx2eB 與 Stx2B 之間的同源性僅為 79%。Stx2e 可被 Stx2 的抗血清中和，但不能被 Stx1 的抗血清中和。
Stx2eA 亞單位包括 297 個氨基酸，分子量為 33.05Ku，是毒素的主要毒力亞單位，具有RNA-N 端糖苷酶活性，是毒素的酶活性部位，具有細(xì)胞毒性作用，主要通過 A 鏈上的 RNA-N-糖苷酶活性對真核細(xì)胞28S-rRNA的5′端432位的腺嘌呤的N端糖苷鍵產(chǎn)生特異的切除作用，使得延伸因子 EF-1 的氨基酰-tRNA 不能夠與 60S 核糖體的亞單位進行結(jié)合，從而使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，導(dǎo)致新陳代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，A 亞單位的空間構(gòu)型也可影響 Stx2e 的毒力和酶促活性。Schlossman 等人利用 X 射線衍射技術(shù)對 Stx2eA 的立體結(jié)構(gòu)進行了觀察，推測出第 167 位谷氨酸（Glu）殘基及第 170 位精氨酸（Arg）殘基對于維持其構(gòu)象具有重要的作用。1992 年，Gordon 等人利用點突變技術(shù)修飾了 Stx2eA 基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果把第 167 位谷氨酸突變成天冬氨酸（Asp），其毒力會下降 104倍，酶促活性下降400 倍；如果把第 170 位精氨酸（Arg）突變?yōu)橘嚢彼幔↙ys），其毒力下降 10 倍，酶促活性下降 5 倍；如果把第 167 位及第 170 位氨基酸同時突變?nèi)サ簦涠玖陆?106倍，酶促活性下降 1500 倍。2007 年，付海兵利用定點突變技術(shù)將 Stx2e 基因第 167 位谷氨酸及第 170 位精氨酸分別突變成為谷氨酰胺和亮氨酸，成功構(gòu)建出了一株豬水腫病大腸桿菌 Stx2e 基因突變菌株，實驗結(jié)果表明，突變菌株對小鼠胃腸等組織的損傷明顯輕于野生株，而對 Vero 細(xì)胞的毒力可降至野生株的 1/500。
Stx2eB 亞單位不具有毒性，通過定點突變驗證表明，對 Vero 細(xì)胞受體發(fā)揮作用的氨基酸即位于 Stx2eB 處。Stx2eB 能與豬的腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，使 Stx2eA 通過“脂流”進入細(xì)胞內(nèi)，從而使 A 亞基發(fā)揮毒性作用。Stx2eB 的特異性受體包括球丙糖基神經(jīng)酰胺（globotriosylceramid，Gb3）、球丁糖基神經(jīng)酰胺（globotetraosylceramide，Gb4）以及半乳糖紅細(xì)胞糖苷酶（galactosylgloboside，Gb5），Stx2eB 可優(yōu)先與 Gb4 和 Gb5 結(jié)合，而與 Gb3 結(jié)合的能力較差。由于 Gb3 存在于 Vero 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞和仔豬小腸細(xì)胞上，Cb4 存在于 Vero 細(xì)胞和豬小腸細(xì)胞上，Gb5 僅存在于 Vero 細(xì)胞上，因此，Stx2e 對HeLa 細(xì)胞的毒性較弱，而對 Vero 細(xì)胞的毒性較強。另外，B 亞單位決定特異性，Ling H 等利用點突變技術(shù)，將第 65 位的 Gln 突變?yōu)?Glu，第 67 位的 Lys 突變?yōu)?Gln，結(jié)果表明，發(fā)生突變的 Stx2eB 亞基與 Gb3 的結(jié)合能力強于 Gb4，說明 Gb3 是 Gb4的替代受體（Tyrrell G J et al，1992；Ling H et al，2000）。Waddell T E 等研究了豬體內(nèi) Stx2e受體分布，結(jié)果表明，豬的眼瞼、小腦、腦脊髓、肝臟、回腸、結(jié)腸等部位均可結(jié)合 Stx2e，并且除肝臟外的其他部位的靜脈也可結(jié)合 Stx2e。利用單克隆抗體做進一步驗證發(fā)現(xiàn)，Stx2e主要結(jié)合在這些器官組織的上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上。目前已經(jīng)有研究證明 Stx2e 可以遏制豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，這也證明了內(nèi)皮組織有 Stx2e 的特異性受體。
2. F18ab（F107）菌毛
F18ab 菌毛是引起豬水腫病大腸桿菌的定植因子，是Rippinger P 等人在研究兩株大腸桿菌（O139: K12: H）107/86 及124/76的生物學(xué)特性時發(fā)現(xiàn)的。該菌毛是蛋白質(zhì)，具有良好的抗原性，在感染豬體內(nèi)能吸附于腸上皮細(xì)胞刷狀緣，但是很少引起腸上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。F107菌毛不凝集包括豚鼠在內(nèi)的多種動物的紅細(xì)胞，該菌毛在體外培養(yǎng)時，于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上不表達(dá)或表達(dá)很差，且其吸附作用不被甘露糖抑制，但在綿羊血平板上，于37℃培養(yǎng)時，能產(chǎn)生許多直徑約4.6nm柔軟長絲狀無血凝性菌毛，而18℃不表達(dá)菌毛，另外還有一些菌株在體外無論是37℃還是18℃均不表達(dá)菌毛，但在動物體內(nèi)卻能正常表達(dá)。Rippinger P等根據(jù)F18的抗原性，將其分為兩個抗原變種，因為該類黏附素都具有相同的抗原決定簇a，又分別具有特異性抗原因子b和c，故將兩個亞型命名為F18ab和F18ac，F(xiàn)18ab菌毛與仔豬水腫病有關(guān)，而F18ac菌毛與斷奶仔豬腹瀉有關(guān)。
F18ab菌毛的編碼基因位于大腸桿菌的基因組中，現(xiàn)已知編碼F18ab菌毛的基因包括：fedA、fedB、fedC、fedE及fedF。fedA是編碼F18ab菌毛主要結(jié)構(gòu)蛋白的基因，基因序列長513bp，編碼170個氨基酸的開放閱讀框（ORF），其中前63bp為FedA信號肽編碼序列，不包括信號肽在內(nèi)的F18ab菌毛主要亞單位分子量約為15.009Ku；fedB、fedC都有一個分泌跨膜蛋白的前導(dǎo)信號肽和一個位于第23、24位氨基酸間的信號肽酶切割位點，編碼F18的推進蛋白（FedB）和伴侶蛋白（FedC），蛋白分子量分別為86.00lKu和23.418Ku，與F18菌毛的合成、裝配、成熟相關(guān)；fedE和fedF基因位于fedA基因的下游，編碼次要亞單位，蛋白分子量分別為15.9Ku和30.3Ku。經(jīng)實驗表明FedE和FedF與菌毛的黏附功能和長度有關(guān)。Smeds A等（2003）通過點突變進一步研究表明，F(xiàn)edF蛋白位于第60位至第109位氨基酸區(qū)域，是F18菌毛結(jié)合到豬空腸上皮細(xì)胞受體所必不可少的，此區(qū)域第72位的Lys、第88位His和第89位His氨基酸殘基，對于高效受體結(jié)合是非常重要的。Semds等和Tiels等一致認(rèn)為FedF可以作為抗F18大腸桿菌的亞單位疫苗候選蛋白。
