王瓊萍 上海交通大學(xué)
候選基因集法的一大關(guān)鍵是基因集的定義。而對(duì)此，模式生物的大量基因芯片實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。基因芯片技術(shù)是近二十年分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的革命性技術(shù)之一，以其高通量、快速、并行檢測(cè)的特點(diǎn)加快了生命科學(xué)研究的步伐。該技術(shù)是通過(guò)把巨量的已知的寡核苷酸，肽核苷酸或 cDNA 固定在一塊面積很小的硅片、玻片或尼龍膜上而構(gòu)成 DNA/RNA 微陣列，然后將樣品基因組 DNA/RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增并摻入標(biāo)記分子后，與位于微陣列上的已知DNA 序列雜交，用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)或質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法等檢測(cè)方法檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度。
它主要是基于近年來(lái)的一種全新的 DNA 測(cè)序方法——雜交測(cè)序法應(yīng)運(yùn)而生的。由于該技術(shù)同時(shí)將大量的探針固定于支持物上，所以可以一次性對(duì)大量序列進(jìn)行檢測(cè)和基因分析，解決了傳統(tǒng)的核酸印跡雜交操作復(fù)雜，操作序列數(shù)量少等缺點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)的突出特點(diǎn)在于其高度的并行性、多樣化、微型化和自動(dòng)化，是生物學(xué)，微電子學(xué)，化學(xué)和計(jì)算機(jī)多學(xué)科高度交叉的應(yīng)用型新型技術(shù)，已成為生物科學(xué)研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域、生物制藥領(lǐng)域和環(huán)境醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了強(qiáng)大的生命力。按其分類方法的不同可以分為不同的類型。按支持物的不同可以分為無(wú)機(jī)片基和有機(jī)合成物片基的基因芯片；按探針陣列的形式可分為原位合成和預(yù)先合成然后點(diǎn)樣的基因芯片；按芯片的功能可分為基因表達(dá)芯片和 DNA 測(cè)序芯片；按探針的類型不同可分為cDNA 微陣列（或 cDNA 微陣列芯片）和寡核苷酸陣列（或芯片）等。
1 基因芯片技術(shù)的工作原理
基因芯片又稱為 DNA 微陣列（DNA microarray），基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法。它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的。所謂基因探針是一段堿基序列，由人工合成，大量的探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锏奶结樕稀＿B接一些如熒光等物質(zhì)，以便于信號(hào)捕捉。根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，待測(cè)的基因混合物就能識(shí)別這些人工合成的基因探針，然后通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析?；蛐酒ㄟ^(guò)應(yīng)用平面微細(xì)加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù)，把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒?yàn)槠涮结樀牟煌?，可以?yīng)用于許多檢測(cè)領(lǐng)域。最常用的芯片應(yīng)用是DNA/寡核苷酸芯片用于基因表達(dá)譜的檢測(cè)。這個(gè)技術(shù)中，來(lái)自兩個(gè)不同樣本的 RNA 用兩種不同的熒光標(biāo)記（通常是 Cy3 和 Cy5），然后再將這些 RNA 雜交到由成百上千個(gè) DNA/寡核苷酸順序排列的玻璃載體上，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱正好反映了轉(zhuǎn)錄水平，然后用特定的熒光波長(zhǎng)掃描芯片得到這些基因在不同組織或細(xì)胞中的表達(dá)譜。最后可以用特定的分析軟件將這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，表明他們具有共有的生物學(xué)功能。
2 基因芯片技術(shù)的技術(shù)流程
基因芯片的技術(shù)流程主要包括以下四個(gè)要點(diǎn)：（1）基因芯片的制備；主要采用三種方法，即光蝕刻合成法，壓電印刷法，點(diǎn)樣法。指的是先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理后，根據(jù)不同方法的不同原理將 DNA/RNA 片段按順序排列在芯片上。（2）樣品制備；生物樣品成分往往比較復(fù)雜，除非常特殊的樣品之外，一般在接觸芯片前，這些樣品往往要經(jīng)過(guò)特殊的處理。為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，來(lái)自血液或組織中的 DNA/mRNA 樣本須先行擴(kuò)增，然后再被熒光素或同位素標(biāo)記成為探針，以提高檢測(cè)的靈敏度。（3）雜交；生物芯片上生物分子的反應(yīng)是芯片檢測(cè)的關(guān)鍵的一步。影響雜交的因素很多，如時(shí)間，溫度及緩沖液的鹽濃度等。雜交條件的選擇要根據(jù)芯片上核酸片段的長(zhǎng)短及其本身的用途來(lái)定。通過(guò)選擇合適的條件使芯片上的生物分子之間的反應(yīng)處于最佳狀態(tài)，減少錯(cuò)配的比率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。（4）信號(hào)檢測(cè)；所謂信號(hào)檢測(cè)主要是雜交圖譜的檢測(cè)和讀出。芯片經(jīng)雜交反應(yīng)后，各反應(yīng)點(diǎn)形成強(qiáng)弱不同的光信號(hào)圖像，用芯片掃描儀和相關(guān)軟件加以分析，即可獲得有關(guān)的生物信息。目前最為常用的是激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)，原理主要是與探針與芯片上的物質(zhì)發(fā)生生物反應(yīng)而被激發(fā)出的熒光經(jīng)過(guò)棱鏡剛好能通過(guò)共聚集小孔，而只有這束熒光才能被探測(cè)器檢測(cè)到，其它熒光信號(hào)則不能。通過(guò)計(jì)算機(jī)處理后就可直接讀出雜交圖譜。因?yàn)檫@種方法的高靈敏度和精確度而被廣泛應(yīng)用，這種方法的缺點(diǎn)是掃描所需時(shí)間較長(zhǎng)。另一種檢測(cè)系統(tǒng)采用 CCD攝像原理，CCD 指的是電荷耦合器件（Charge Coupled Device），它是一種半導(dǎo)體成像器件，所需的掃描時(shí)間較短，缺點(diǎn)是靈敏度和精確度較低。此外，近年來(lái)還發(fā)展了多種檢測(cè)方法，目前正在研究的替代方法有質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測(cè)、乳膠凝集反應(yīng)、直接電荷變化檢測(cè)等。
