斷奶仔豬盡管處于高速生長的階段，但往往會因腸道功能發(fā)育不全和內生態(tài)環(huán)境紊亂陷入亞健康危機[1]。仔豬腸道不僅具有消化和吸收營養(yǎng)物質的功能，作為分泌和免疫器官，還能將機體內環(huán)境與細菌及毒素隔絕，因此腸道健康對仔豬健康養(yǎng)殖至關重要[2]。而斷奶應激刺激腸道干細胞快速分化和增殖，以適應斷奶引起的變化。然而，分化過程的加速可能導致未成熟腸上皮細胞和杯狀細胞比例的增加，主要表現為隱窩深度加深和腸絨毛高度降低，影響腸通透性，降低腸道對毒素和病原體的屏障功能[3]。飼料端禁抗之后，仔豬腸道病原微生物的失控促使疾病頻發(fā)、免疫應激、屏障功能損傷等問題日益嚴峻，說明腸道發(fā)育的機制是調控腸上皮細胞發(fā)育的關鍵[4]。因此，文章系統綜述了豬腸道發(fā)育進程的最新研究方法，以期進一步推動無抗養(yǎng)殖技術的開發(fā)與應用，為我國生豬產業(yè)安全、高效、高質量的健康發(fā)展提供參考。
1 豬腸道研究模型
傳統的腸道模型雖然可以在完整動物中或離體研究中進行評估，但成本高昂且勞動強度大。為了更高效研究豬腸道發(fā)育和營養(yǎng)調控，研究者通過培養(yǎng)細胞和類器官等方便、經濟、易操作的體外模型闡明其作用機制[5]。
1.1 腸道上皮細胞
豬腸道是由從胃到肛門的連續(xù)消化道組成，其中腸壁由內至外分別是黏膜層（上皮層）、黏膜下層、固有肌層和漿膜層。腸上皮由大量重復自我更新的隱窩-絨毛軸（crypt-villus axis, CVA）單位組成，其中絨毛延伸出腸腔，隱窩內陷到下層間質[6]。腸道上皮細胞（intestinal epithelial cells, IEC）分為吸收型細胞和分泌型細胞，包括腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、簇細胞、腸內分泌細胞和微皺褶細胞等，具有營養(yǎng)消化吸收、屏障功能、免疫功能、生物節(jié)律等功能[7]。隱窩中有腸干細胞和轉運擴增細胞，隱窩底部的腸道干細胞（intestinal stem cells, ISC）嚴格調控著腸道的發(fā)育，IEC發(fā)育過程中，腸道由空泡狀胎兒型上皮細胞（形成球形胎兒型類器官）逐步分化為成年上皮細胞（形成花瓣狀成年型類器官）[8]。仔豬腸道上皮發(fā)育過程伴隨消化吸收方式的變化，空泡狀胎兒型干細胞內含有大量溶酶體，通過胞吞作用吸收蛋白質，通過空泡內部溶酶體消化成小肽或氨基酸，從而實現細胞內消化，而成年上皮細胞逐步向細胞外消化轉變，此時氨基酸轉運載體顯著高于胎兒型上皮細胞[9]。
IEC作為腸道免疫防御系統的第一道防線，在抵抗腸道病原菌感染過程中發(fā)揮了重要作用，營養(yǎng)感知信號與宿主防御功能在IEC中相互協調具有重要的生物學意義[10]。例如，斷奶仔豬IEC膜蛋白糖基化水平降低，腸道花生四烯酸、精氨酸和天冬氨酸等代謝通路的相關基因或蛋白質發(fā)生顯著變化[11]。此外，隨著腸道隱窩-絨毛軸上皮細胞的分化成熟，負責營養(yǎng)物質消化吸收的蛋白質在隱窩-絨毛軸上呈現獨特的表達模式，而細胞骨架等蛋白質隨分化表達上調；mTOR信號通路相關蛋白的表達和細胞抗氧化能力表達下調[12]。
1.2 腸道類器官
傳統消化道模型存在難以滿足豬精準營養(yǎng)需求研究；而動物模型具有可操作性差、重復性低、菌群易感性高的局限性；腸道細胞系可用的不多，無法重現隱窩-絨毛結構，因此類器官是體外模擬腸道上皮結構和功能的最佳模型。腸道類器官（intestinal organoid, IO），又稱迷你腸（mini-gut），是由離體的ISC和隱窩在適量的生長因子介導下，在基質膠中經由3D培養(yǎng)模式形成具有完整腸道組織的結構，近年來被用作腸道上皮細胞更新和發(fā)育及調控的體外模型[13]。研究發(fā)現，這些IO含有所有種類的腸上皮功能細胞，包括腸上皮細胞、腸內分泌細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和Lgr5+干細胞。IO含有多個隱窩結構，并相互連接形成中間有腸腔的迷你腸。豬IO體外模型的建立突破從以往研究中僅能觀察表型的局限性，拓展到功能細胞單位層次，為更好地揭示環(huán)境因子與豬腸道互作機制奠定了基礎[14]。
迷你腸研究的新方法包括腸道芯片和懸滴培養(yǎng)體系。通過“單腸道類器官微流控芯片”可為IO單顆粒實時示蹤提供穩(wěn)定平臺，實現高通量篩選能促進腸道上皮細胞發(fā)育的營養(yǎng)物質[15]。該芯片采用截面型微流控芯片模具設計，在上皮通道之上和血管通道之下含有多孔柔性聚二甲基硅氧烷薄膜，通過精準進樣及液體循環(huán)控制模塊、片上實時電化學監(jiān)測模塊和熒光標志粉實時圖像捕捉模塊對單病毒實時示蹤和腸道屏障功能實時監(jiān)測[16]。在懸滴培養(yǎng)體系中，將IO重懸于特質的培養(yǎng)基中，然后將細胞懸液分裝于96孔Perfecta 3D懸滴板中培養(yǎng)。懸滴系統需要的培養(yǎng)基更少，具有更快的細胞接種過程，同時規(guī)避不同批次培養(yǎng)基的異質性所造成的實驗誤差[17]。
2 豬腸道研究技術
研究腸道發(fā)育和健康的主要技術手段主要包括生化分析及技術分子生物學技術、細胞培養(yǎng)（細胞系、原代、類器官等）、同位素標記及高通量組學（轉錄組、蛋白質組、代謝組學、單細胞測序等）、生物信息學關聯分析等[18]。
2.1 生化分析及分子生物學技術
生化分析及分子生物學技術是腸道上皮細胞研究的基本技術手段，常用的包括生理生化指標檢測、凝膠電泳分子雜交、PCR技術、DNA物理圖譜、DNA序列測定以及基因芯片、基因敲除等。例如，在百草枯誘導的腸道氧化應激體內外模型中，抑制敲除腸髓樣分化因子88（MyD88）基因可緩解氧化應激誘導的腸上皮細胞的細胞凋亡、周期阻滯、DNA損傷和線粒體功能障礙，其機制是通過調控mTOR-p53通路促進自噬，進而減少活性氧的積累。該研究廣泛應用現代生化分析及分子生物學技術，揭示了MyD88調節(jié)腸道氧化應激的重要作用，為營養(yǎng)調控仔豬腸道氧化損傷提供了潛在靶點[19]。
2.2 高通量組學
IEC增殖、分化和凋亡在腸道發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，這種協調需要大量而即時的信號通路的干預，IEC增殖與凋亡平衡的紊亂可能導致各類腸道疾病產生[20]。miRNAs在腸道上皮的生長性能，腸道形態(tài)，營養(yǎng)吸收和屏障功能中起著至關重要的作用，如miRNA-29，它靶向NF-κB抑制因子和claudin 1，以增加腸通透性[21]。為了鑒定調控IEC更新的miRNAs，Zou等[22]對絨毛上細胞（F1）和隱窩細胞（F3）進行了高通量測序，結果表明miRNA-100可促進豬腸上皮細胞的分化和凋亡，抑制腸上皮細胞的增殖和遷移。
2.3 生物信息學關聯分析
腸道微生物組是一個復雜的微生物生態(tài)系統，不僅影響日糧的消化和營養(yǎng)物質的吸收，其活動和相互關系對仔豬腸道健康至關重要。仔豬斷奶應激往往導致腸道菌群紊亂，使得免疫功能缺失和疾病易感性進一步增加[23]。Bai等[24]基于Miseq測序僅在各個分類水平上進行群落結構的統計分析，發(fā)現飼糧中添加0.2%~0.8%的牡丹皮可改善斷奶仔豬腸道菌群，包括提高微生物豐富度，增加厚壁菌門和乳酸菌屬的豐度，這些菌屬可能與提高營養(yǎng)吸收水平和腸黏膜免疫相關；以及降低擬桿菌屬和腸球菌屬的豐度，這些菌屬可能與潰瘍性結腸炎、結直腸癌等胃腸疾病相關。
3 豬腸道發(fā)育影響因素
3.1 遺傳因素
遺傳因素是影響豬腸道發(fā)育的主要因素，闡明其機制和規(guī)律是尋求調控手段的先決條件。豬小腸長度與平均日增重及平均日采食量顯著正相關，因此可以通過調控仔豬ISC增加仔豬小腸長度來改善生長性能[25]。地方豬和外來豬腸道上皮發(fā)育往往存在顯著差異。大白豬在小腸長度和小腸長度指數（長度/體重）顯著高于地方豬種沙子嶺豬，但是沙子嶺豬在絨毛高度和黏膜消化酶活性及轉運載體表達上顯著高于大白豬，可能地方豬和外來豬在腸道營養(yǎng)消化吸收上采取了不同的適應機制[26]。盡管小腸長度是一個高營養(yǎng)代謝器官，隨著長度的增加，其營養(yǎng)消耗也增加，但是總體上調控腸道發(fā)育還是可以改善日增重和采食量。
3.2 代謝因素
由于門靜脈引流的內臟（腸、胰腺、脾和胃）僅占體重的5%，卻占全身能量消耗的約30%，并且腸道的能量利用率較高，故了解哺乳期間IEC能量代謝變化對調控新生仔豬腸黏膜發(fā)育具有重要意義[27]。細胞分化過程中，對營養(yǎng)物質的消化和吸收相關蛋白質的表達上調；結構和酶調節(jié)的蛋白質表達顯著下調，從7、14、21日齡仔豬空腸中段分離出隱窩細胞，利用同位素標記進行相對和絕對定量分析蛋白質合成，結果表明哺乳期仔豬腸道隱窩上皮細胞的能量代謝發(fā)生了變化，這種代謝模式因葡萄糖、脂肪酸和氨基酸（涉及糖酵解和檸檬酸循環(huán)代謝相關蛋白的產量）而異[28]。此外，斷奶仔豬對飼糧粗蛋白（CP）水平極為敏感，腸道中消化不良的高水平CP會促進致病菌的產生，增加消化系統疾病的風險，低蛋白日糧添加維生素B6可能通過調節(jié)氨基酸代謝影響腸道健康[29]。
3.3 應激因素
腸上皮依賴于復雜的蛋白質混合物在不同的細胞間連接成屏障，腸黏膜的修復是上皮完整性和連續(xù)性的快速重建，包括鄰近損傷表面的上皮細胞遷移到損傷表面。氧化應激誘導黏膜細胞有效能量的供應不足，不能維持正常的更新及損傷修復，從而抑制仔豬生長潛力的完全發(fā)揮[30]。哺乳期仔豬小腸細胞增殖、AKP活性和細胞間連接蛋白表達量隨日齡逐漸增加。斷奶14日齡血漿D-乳酸含量和小腸Kv通道表達增加，絨毛高度/隱窩深度、細胞增殖、AKP活性和小腸細胞間連接蛋白表達降低。黏膜細胞增殖分化從出生至21日齡逐漸升高；早期斷奶后黏膜損傷在第3天至第5天最為嚴重，隨后逐漸恢復[31]。細胞自噬是細胞反應中氧化還原信號的一個主要傳感器，在緩解機體氧化應激反應中發(fā)揮重要作用。氧化應激狀態(tài)下，活性氧（ROS）能通過自噬形成過程中的各種通路誘導自噬的產生。研究表明，嘔吐毒素（DON）誘導自噬缺失細胞ROS水平升高，導致細胞死亡，ER折疊蛋白表達降低導致細胞應激反應失敗。自噬通過IKK通路緩解氧化應激保護腸上皮細胞免受嘔吐毒素DON的毒害作用，利用CRISPR-Cas9技術敲除豬腸上皮細胞中的Atg5（誘導自噬缺失），DON誘導正常細胞自噬，不會誘導Atg5-/-細胞自噬[32]。
4 豬腸道發(fā)育營養(yǎng)調控
早期斷奶時腸道適應期所進行的各種適應性改變的最終結果就是腸道成熟。腸道成熟的實質是腸道重建，即由新分化的具有成熟功能的腸細胞逐步替代原有腸細胞的過程。小腸的功能單位是絨毛，小腸絨毛結構的變化的根本原因是黏膜細胞的有效能量的供給不足，必然導致腸細胞內源性“饑餓”，細胞不能獲得進行多種生理活動所需的能量，導致小腸黏膜的形態(tài)、結構異常，絨毛變短，隱窩變深[33]。我們通過營養(yǎng)手段來調節(jié)斷奶應激造成的腸道損傷。包括從營養(yǎng)水平、基因轉錄調控（DNA甲基化、染色質開放型、組蛋白修飾、轉錄因子）、微生物菌群-上皮細胞-免疫細胞互作等方面干預腸上皮細胞更新機制和腸道營養(yǎng)素吸收代謝規(guī)律，從而實現仔豬腸道健康和生長性能提升。
氨基酸而非血糖是小腸黏膜的主要能量來源，腸道細胞利用谷氨酰胺的基礎代謝和ATP生成均高于葡萄糖，驗證了腸上皮細胞優(yōu)先利用谷氨酰胺作為能量來源的結論。Qi等[34]發(fā)現在正常能量供應下，谷氨酰胺、谷氨酸和Asp可以通過補充Krebs循環(huán)恢復小腸能量穩(wěn)態(tài)，下調AMPK通路。然而,當仔豬處于低能量供應下，Gln、Glu和Asp不足以維持腸道能量平衡，此時機體會激活AMPK信號通路、脂肪酸的beta氧化及線粒體生物合成途徑以滿足仔豬腸上皮細胞的高能量需求，維持腸道黏膜能量穩(wěn)態(tài)。
多胺作為腸道的“成熟因子”，在幼齡動物的消化生理、營養(yǎng)代謝以及正常生長中發(fā)揮重要的生物學作用[35]。但是在新生仔豬腸道中，精氨酸酶活性很低，而脯氨酸氧化酶活性極高，所以在新生仔豬腸道中多胺的合成并不以精氨酸為主，而以脯氨酸為主。哺乳期仔豬灌喂腐胺及脯氨酸顯著提高了斷奶仔豬空腸PCNA陽性細胞率，有效地增加了空腸隱窩細胞的增殖能力；并且，脯氨酸提高了空腸堿性磷酸酶活性，促進了空腸細胞的分化[36]。維生素A（VA）通過影響仔豬ISC干預腸道發(fā)育和消化吸收功能，進而調控仔豬生長性能。與對照組相比，仔豬平均日增重和飼料轉化率在第8~14天顯著增加，這可能與腸道分化相關的Lgr5+基因豐度顯著升高有關[37]。
日糧中鐵營養(yǎng)影響杯狀細胞的分化和功能，缺鐵顯著抑制仔豬腸道上皮發(fā)育成熟。中/高濃度鐵狀態(tài)下的結腸杯狀細胞數量顯著高于低鐵狀態(tài)。缺鐵抑制仔豬腸道上皮發(fā)育主要表現為腸道器官指數（長度和重量）和形態(tài)結構（絨毛高度和隱窩深度、絨毛表面積）顯著降低；空泡狀胎兒型上皮細胞增多，成年型上皮細胞標志基因表達降低[38]。而甘氨酸螯合鐵（FebisGly）通過調控APMK/FOXO通路提高腸道抗氧化能力，增加仔豬腸道GSH水平，降低腸道MDA水平，通過增加結腸厚壁菌屬豐度、降低梭菌屬豐度，影響腸道次級膽汁酸組成和代謝[39]。相似地，銅（Cu）是動物生長所必需的微量元素，斷奶期飼糧中添加硫酸銅（CuSO4）改善了育肥豬的腸道形態(tài)，這可能是通過促進細胞增殖和提高ISC活性來實現的[40]。
自噬通過分解代謝回收細胞成分和受損的細胞器，以應對營養(yǎng)剝奪、病毒感染和基因毒性應激等逆境，自噬修飾劑常用于體內外調控這一過程[41]。Nalbandian等[41]發(fā)現在仔豬斷奶的背景下，自噬修飾劑氯喹（CQ）和雷帕霉素（RAPA）呈現出不同的效果，前者CQ通過在溶酶體中酸化和干擾液泡H+ATP酶來逆轉自噬，灌服CQ后能部分抑制腸道細胞自噬，緩解仔豬斷奶過程的生長抑制作用以及改善腸黏膜形態(tài)結構，而后者RAPA是mTOR信號通路機制靶點的特異性抑制劑，則加劇了斷奶引起的腸黏膜形態(tài)損傷。
以植物提取物為主的天然產物是保持腸道健康的新趨勢。鞣花酸（EA）是分布于石榴等眾多水果或堅果中的天然多酚類抗氧化劑。EA緩解了氧化應激引起的斷奶仔豬生長停滯，激活氧化應激仔豬腸道Nrf2信號通路來改善黏膜屏障功能和提高緊密連接蛋白的表達，從而促進仔豬腸道溶酶菌和免疫球蛋白A的分泌[42]。在與之相關的試驗中，50 mg/kg和100 mg/kg EA顯著提高了百草枯染毒過程中與Nrf2/Keap1信號通路激活相關的抗氧化酶的活性，并且增加盲腸L. amylovorus和L. reuteri的相對豐度，有效地改善了百草枯誘導的肝臟氧化和炎癥損傷，重塑腸道微生物結構與多樣性[43]。微囊植物精油、普通精油、金霉素對斷奶仔豬盲腸、結腸微生物β多樣性的影響。低劑量微囊精油（100 mg/kg）可顯著降低盲腸和結腸中潛在致病菌/有益菌的比值，效果優(yōu)于普通精油?？股貢呓Y腸潛在致病菌/有益菌的比值。
5 小結
腸道是最重要的營養(yǎng)吸收和代謝場所，只有保證腸道的健康發(fā)育，才能保證畜牧產業(yè)的平穩(wěn)可持續(xù)良性發(fā)展，為我國的助農富農推進鄉(xiāng)村振興添磚加瓦。本文綜述了近幾年仔豬腸道發(fā)育與營養(yǎng)調控應用的研究進展，從基因、蛋白質和代謝物層面系統揭示了斷奶仔豬腸上皮細胞隱窩-絨毛軸結構發(fā)育和分化特性以及斷奶后腸道的適應性變化規(guī)律，闡明了眾多替抗產品等對斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響和作用機制。
參考文獻及更多內容詳見：
飼料工業(yè)，2023，44（2）：1-6
