豬是多殺性巴氏桿菌的易感動(dòng)物之一，豬群中流行的多殺性巴氏桿菌血清型多為Ａ型和Ｄ型，主要引發(fā)豬肺疫和豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎。近年來(lái)，豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染病例報(bào)道較少。2017年2月下旬，河南濮陽(yáng)某800頭基礎(chǔ)母豬規(guī)?；瘓?chǎng)，保育后期、育肥前期的豬群陸續(xù)發(fā)病，送來(lái)我單位診斷，筆者通過(guò)臨床綜合診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染，現(xiàn)將報(bào)道如下。
1、臨床癥狀
該豬場(chǎng)存欄保育后期、育肥前期的豬群約1?500余頭，50～120日齡，從2月上旬，相繼陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁，食欲減退，體溫升高為41～42℃，眼結(jié)膜潮紅，腹式呼吸，喘氣，四肢無(wú)力，趴臥地面，耳廓、腹部、四肢皮膚有紫紅色出血斑塊（圖1）；有的豬晚上發(fā)病、早上死亡，口鼻流出血樣泡沫 ；有的關(guān)節(jié)腫大、跛行；有的保育仔豬頭頸歪斜，共濟(jì)失調(diào)，走路搖晃，病程長(zhǎng)的保育仔豬嚴(yán)重消瘦。整個(gè)豬場(chǎng)自發(fā)病以后，發(fā)病率約為40%，死亡率約為15%，使用氟苯尼考、替米考星、強(qiáng)力霉素等，療效不明顯。
腹股溝淋巴結(jié)腫大（圖1），頜下淋巴結(jié)腫大；心包積液（圖2），心包液內(nèi)有少量的纖維性物質(zhì)；有的豬心外膜有大量纖維素物質(zhì)包裹，呈絨毛心；氣管內(nèi)有大量出血泡沫液體；肺臟出血，呈紫紅色，有肉變區(qū)，有的豬肺氣腫，切面流出泡沫樣液體；有的豬腎臟針尖狀出血點(diǎn)；關(guān)節(jié)積液增多，內(nèi)有纖維絮狀物。
圖1 腹部皮膚出血和腹股溝淋巴結(jié)出血
圖２ 心包積液
3.1、主要試劑
TSA（胰蛋白大豆瓊脂）、TSB（胰蛋白大豆肉湯）購(gòu)自美國(guó)BD（Becton,Dickinson?and?Company）公司；TSA平板、TSB肉湯配制時(shí)，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）終濃度為10mg/L和犢牛血清（終濃度50mL/L)；2×Taq?PCR?MasterMix/with?dye購(gòu)自加拿大ABM公司；Marker?2000等購(gòu)自寶生物工程（大連 )有限公司；藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。
3.2、引物與合成
豬鏈球菌特異性擴(kuò)增引物，參照文獻(xiàn)，
P1:GCAGCGTATTCTGTCAAACG，P2:CCATGGACAGATAAAGATGG
預(yù)期擴(kuò)增片段大小為689bp；多殺性巴氏桿菌特異性擴(kuò)增引物，參照文獻(xiàn)，
P1:5 ′ -ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3 ′，
P2:5 ′ -GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′
預(yù)期擴(kuò)增片段大小為457bp，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
3.3、分離、培養(yǎng)
無(wú)菌采集患豬肺臟，引火自燃消毒肺臟表面，使用滅菌剪刀與鑷子，剪去肺臟表面，采集深部肺臟組織，涂抹于TSA平板（添加有NAD，犢牛血清），37℃培養(yǎng)24～48h，生長(zhǎng)出一種白色、半透明、圓形菌落，約為0.5～1mm；
另外一種淡淺色、圓形、濕潤(rùn)菌落，大小約為1～1.5mm，進(jìn)一步將兩株菌落接種于 TSA 平板（添加有NAD，犢牛血清）純化、傳代。
3.4、染色、鏡檢
無(wú)菌采集病變部位的肺臟組織，染色后，觀察到疑似兩種細(xì)菌，一種為革蘭氏陽(yáng)性、單個(gè)或短鏈球菌，另外一種為革蘭氏陰性短桿菌或個(gè)別稍長(zhǎng)桿菌（圖3）。
圖３ 肺膈葉病料中疑似鏈球菌、巴氏桿菌（革蘭氏染色）
圖４ 分離鏈球菌（革蘭氏染色）
圖５ 分離多殺性巴氏桿菌（革蘭氏染色）
3.5、PCR鑒定
根據(jù)參考文獻(xiàn)，利用PCR方法，擴(kuò)增疑似為豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌的特異性片段，結(jié)果顯示擴(kuò)增出豬鏈球菌689bp特異性片段、多殺性巴氏桿菌457bp片段，與預(yù)期一致（圖6），表明分離兩種細(xì)菌為豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌。
圖６ 分離細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果
選擇18種藥物，采用紙片擴(kuò)散法，測(cè)定分離的豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌藥物敏感性，其結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、青霉素、恩諾沙星、環(huán)丙殺沙星菌等敏感，因此，建議該養(yǎng)殖戶，針對(duì)發(fā)病嚴(yán)重豬只，使用氨芐西林、青霉素、或者恩諾沙星單獨(dú)，或者聯(lián)合注射治療，同時(shí)使用阿莫西林拌料，適當(dāng)加大用藥劑量，連用5～7d。
4、分析與討論
通過(guò)臨床癥狀與病變，容易診斷為急性傳染性胸膜肺炎，因此筆者采用TSA 平板（加有NAD、犢牛血清）分離發(fā)病豬群感染的病原，是為了判斷能否分離到傳染性胸膜肺炎放線桿菌，及副豬嗜血桿菌（該培養(yǎng)基，能夠適合這兩種菌的生長(zhǎng)）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離到的兩種細(xì)菌分別為豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌，結(jié)合臨床癥狀和病理變化，最終確診為豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染，混合感染時(shí)，病情更加復(fù)雜，增加診斷難度，必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。
根據(jù)養(yǎng)殖戶反映，使用氟苯尼考、替米考星、強(qiáng)力霉素等藥物，療效不佳，筆者推測(cè)豬群感染耐藥性菌株所致。因此，分離豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌，進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示，氨芐西林、阿莫西林、青霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等藥物敏感。
最后，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使用氨芐西林、青霉素、或者恩諾沙星聯(lián)合注射治療，阿莫西林拌料給藥，適當(dāng)加大劑量，療效明顯。獸醫(yī)臨床中，由于濫用藥物，耐藥性問(wèn)題相當(dāng)嚴(yán)重，分離病原菌、進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)于正確指導(dǎo)用藥十分重要。
（盧建洲，蔣增海等 豬業(yè)科學(xué)）
