摘要：近年來，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯氏菌病發(fā)病率有上升的趨勢。借鑒已消除該病國家的防控和凈化措施，疫苗的免疫預(yù)防是關(guān)鍵因素。除了傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)疫苗牛種S19株、羊種Rev.1株、豬種S2株以及牛種RB51株，利用基因工程技術(shù)針對布魯氏菌侵害機體的過程及其免疫抗原物質(zhì)構(gòu)建的新興疫苗得到不斷發(fā)展。筆者對布魯氏菌的特點、危害、致病機制及動物疫苗應(yīng)用進展進行介紹。

    布魯氏菌?。ê喎Q布?。┦且环N嚴重的人獸共患傳染病，致病菌為布魯氏菌（Brucella），除了可以通過皮膚、黏膜感染，還可通過消化道和呼吸道感染。我國將其列為乙類傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為B類法定傳染病。

    1 布魯氏菌的特點

    布病是一個流傳久遠的疾病。據(jù)考證，公元前750年，古埃及人的尸體顯示有其生前患有布病的癥狀（明顯的骨關(guān)節(jié)炎癥及損傷等）。1887年，英國軍醫(yī)David Bruce從死于熱性病的士兵脾臟中分離并發(fā)現(xiàn)布魯氏菌。此間，經(jīng)過人類不斷研究，完善了對該菌的認識。布魯氏菌長0.6μm ～1.5μm、寬0.5μm～0.7μm，為革蘭氏陰性球桿菌或短桿菌，主要寄生部位是動物細胞內(nèi)。無鞭毛和芽孢，一般無莢膜，具有革蘭陰性菌典型的3層膜結(jié)構(gòu)，即肽聚糖層外有特殊的3層外膜結(jié)構(gòu)，由內(nèi)向外依次為脂蛋白、脂質(zhì)雙層和脂多糖。根據(jù)外膜上的脂多糖（lipo-polysaccharides，LPS）是否含有O鏈結(jié)構(gòu)，可以將布魯氏菌分為光滑型（smooth，S）和粗糙型（rough，R）。其中，R型是O鏈缺失型，在一定條件下，由于參與LPS合成基因的突變和缺失可使S型和R型之間相互轉(zhuǎn)換。根據(jù)對宿主的偏好，布魯氏菌屬分為6個經(jīng)典種，分別為羊種、牛種、豬種、犬種、沙林鼠種和綿羊附睪種。隨著研究范圍的擴大，又相繼鑒定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.ceti（鯨型）以及 B.inopinata（分離自人體）。我國流行的主要是羊、牛和豬種布魯氏菌，其中羊種最為多見，且病情較復(fù)雜、嚴重。

    2 致病機制及研究現(xiàn)狀

    布魯氏菌侵入機體后，到達的第一個免疫器官是淋巴結(jié)，在這里吞噬細胞會將其吞噬。如未將其殺滅，則會在胞內(nèi)大量繁殖，使吞噬細胞破裂而解體，大量細菌進入淋巴液和血循環(huán)。此時機體免疫系統(tǒng)啟動，宿主出現(xiàn)發(fā)熱。當細菌再次到達淋巴結(jié)等器官，宿主體溫恢復(fù)。循環(huán)往復(fù)，臨床上稱為“波浪熱”。人感染布魯氏菌后常表現(xiàn)為發(fā)熱和關(guān)節(jié)疼痛等癥狀。如在急性期治療不徹底，轉(zhuǎn)為慢性，更有甚者會喪失勞動能力。動物感染后，母畜常出現(xiàn)流產(chǎn)、不孕，公畜出現(xiàn)睪丸炎，影響家畜生產(chǎn)繁殖能力以及畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

    鑒于布病對人類健康及畜牧業(yè)的嚴重威脅，防治工作刻不容緩。其中，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用是關(guān)鍵。隨著對布魯氏菌致病機制及機體免疫應(yīng)答程序的深入研究，特別是近年來基因研究技術(shù)的發(fā)展和普及，極大促進了布病疫苗研制工作。自2002年羊種16M菌株的基因組序列公布后，其他布魯氏菌株的測序已經(jīng)完成。各菌株間有很高的序列一致性，但存在不同程度缺失、插入、倒置和移位現(xiàn)象。除豬種3型686株含1條染色體外，其余布魯氏菌中都含2條環(huán)形染色體。染色體Ⅰ約2.11Mbp，GC含量為57.2%；染色體Ⅱ約1.18Mbp，GC含量為57.3%。

    脂多糖（LPS）和外膜蛋白（outer-membraneprotein，OMP）是機體免疫系統(tǒng)識別布魯氏菌的主要抗原。LPS的O鏈是布魯氏菌的活性部分，參與抑制宿主細胞的凋亡，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)。當S型菌株突變?yōu)镽型菌株意味著其毒力的下降。目前，血清學(xué)是常用的檢測布魯氏菌的方法，如虎紅平板凝集實驗（RBPT）、標準試管凝集實驗（SAT）和補體結(jié)合實驗（CFT）。這些方法都是基于LPS的O鏈的抗體檢測，由于R型布魯氏菌疫苗免疫時，機體不會產(chǎn)生針對O側(cè)鏈的抗體，故血清學(xué)方法可區(qū)分R型布魯氏菌疫苗的自然感染和疫苗免疫。巨噬細胞與胎盤滋養(yǎng)層細胞是布魯氏菌感染的主要靶細胞，它還能在樹突狀細胞中也可生存。區(qū)別于其他病原微生物，布魯氏菌不具備經(jīng)典的毒力因子，且在兩種宿主中會產(chǎn)生不同的基因子集（sub-sets of genes），致使布魯氏菌的致病機制更為復(fù)雜多變。目前，已鑒定分離的毒力因子有脂多糖、外膜蛋白、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等應(yīng)激反應(yīng)蛋白。如此繁多的毒力因子，可降低細胞遞呈能力，抑制細胞凋亡。

    3 疫苗分類

    因減毒活疫苗可以刺激機體的細胞免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生良好的免疫保護效果，故在實際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。經(jīng)典的布魯氏菌動物疫苗有S19和Rev.1。我國常用的是S2、M5和S19，南美的部分國家和美國多使用RB51。

    3.1 傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)的疫苗株

    根據(jù)疫苗株的獲得途徑不同，可將其劃分為3類：①通過細菌的傳代培養(yǎng)，直接篩選出弱毒活菌苗，如S19、Rev.1和M5等；②根據(jù)細菌特性利用生物化學(xué)手段將其滅活，后期加入佐劑制成的滅活苗，如45/20、H38等；③在傳代培養(yǎng)中篩選出的自然突變株，如RB51。根據(jù)疫苗株來源不同，又可分為光滑型疫苗和粗糙型疫苗。

    3.1.1 常見的光滑型疫苗

    S19（B.abortus strain 19）疫苗是在新澤西某牛場的牛奶中分離，經(jīng)實驗室傳代培養(yǎng)1年以上自然減毒獲得。因該菌株毒力較強，有感染人和使母畜流產(chǎn)的風(fēng)險，最終被美國農(nóng)業(yè)部禁用。20世紀60年代我國引進該疫苗株。該菌株是光滑型，可以持續(xù)刺激機體產(chǎn)生細胞免疫，提供保護力，但無法區(qū)分疫苗免疫和自然感染。

    Rev.1（B.melitensis REV.1）疫苗是Elberg等1957年從B.melitensis 強毒株6056血清中分離培養(yǎng)得到的，具有鏈霉素抗性。該菌株在適當條件下毒力可以完全恢復(fù)。較之S19有更高的流產(chǎn)率，同時意味著其有更完整的抗體特征刺激機體免疫系統(tǒng)，從而獲得更好的保護力。

    M5疫苗是1962年哈爾濱獸醫(yī)研究所通過對B.melitensis強毒株M28連續(xù)雞減毒獲得。該菌株有S型變異為R型的不穩(wěn)定性，目前仍用于山羊的免疫，免疫后可保護1年時間。

    H38疫苗是1964年Renoux等將馬耳他布魯菌53H38號強毒菌株的培養(yǎng)液，經(jīng)福爾馬林滅活后加入佐劑制成。屬于S型，在山羊和綿羊應(yīng)用效果較好，安全性高，但存在局部化膿現(xiàn)象。

    S2（B.suis strain 2）疫苗是1952年我國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所從豬流產(chǎn)胚胎中分離得到的。該疫苗株與S19和Rev.1相比毒力較弱，在牛、羊、豬等畜種都能產(chǎn)生良好的免疫效果。丁家波等通過試驗動物比較S2、M5和A19 3種疫苗株的安全性和免疫保護效果，得出S2除了具有良好的免疫保護力外，還具有更優(yōu)良的安全性。

    3.1.2 常見的粗糙型疫苗

    RB51疫苗是S型牛種2308菌株經(jīng)利福平和青霉素的反復(fù)傳代獲得的突變株，特點是在2308株編碼糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的wboA基因中插入一段IS711序列。它在美國和南美地區(qū)被廣泛使用，但該疫苗的使用需嚴格控制劑量和免疫途徑，否則會導(dǎo)致嚴重感染和母畜流產(chǎn)。

    45/20疫苗是1922年從患布病牛的體內(nèi)分離后又在豚鼠20次傳代培養(yǎng)得到的R型減毒滅活疫苗。免疫保護力較好，但存在R型與S型變異的不穩(wěn)定性，逐漸被淘汰。

    3.2 基因工程疫苗

    利用基因工程（蛋白質(zhì)工程）技術(shù)對現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)疫苗株進行改造培養(yǎng)出的工程菌株、重組質(zhì)粒或代謝產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）等稱為基因工程疫苗。如美學(xué)者利用RB51菌株構(gòu)建了超量表達Cu/Zn超氧化物歧化酶的重組株，優(yōu)化原菌株的免疫保護力。此外，針對某基因區(qū)插入、替換或剔除特定序列從而構(gòu)建突變株也屬于此類。

    3.2.1 DNA疫苗

    常見的DNA疫苗有p39（T淋巴細胞抗原）、L7/L12（核蛋白）、Omp31（外模蛋白）、Omp25（外模蛋白）、GroEL（熱休克蛋白）等。制備的原理是把含有目標抗原基因的重組質(zhì)粒直接注射或感染動物細胞，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面、持久的免疫應(yīng)答。DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞免疫反應(yīng)較蛋白質(zhì)疫苗要強烈，有良好的研究前景。

    3.2.2 蛋白質(zhì)疫苗

    利用含有目標蛋白的基因序列在真核或原核細胞中表達產(chǎn)物（蛋白或多肽）制成的蛋白質(zhì)疫苗，又稱亞單位疫苗。篩選最佳抗原是重組蛋白質(zhì)疫苗的研究關(guān)鍵，后期常與其他佐劑相聯(lián)合使用，使機體產(chǎn)生更強烈的免疫應(yīng)答。蛋白質(zhì)疫苗的主要缺點是自身在機體內(nèi)無法復(fù)制，且生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，故尚未普及。

    3.2.3 標記疫苗

    為區(qū)分疫苗免疫和自然染病，利用基因置換、刪除或缺失技術(shù)構(gòu)建的工程菌，稱為標記疫苗。如將抗卡那霉素基因置換Rev.1菌株的p39基因（產(chǎn)物為胞質(zhì)結(jié)合蛋白），獲得Rev.1-Δp39 疫苗株；剔除Rev.1 bp26序列的CGV26或者CGV2631獲得的疫苗株等。我國學(xué)者對M5-90菌株進行同源重組構(gòu)建的基因缺失株也屬于標記疫苗類。

    較之傳統(tǒng)的疫苗，基因工程疫苗既保留了原有免疫活性，又解決了殘余毒力強的安全性問題，并可區(qū)分疫苗免疫和自然染病。布魯氏菌侵入機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及其逃避巨噬細胞的系統(tǒng)研究成為基因工程疫苗的發(fā)展鉗制因素。

    4 小結(jié)

    隨著我國畜牧業(yè)的集約化發(fā)展，布病的防治工作不容忽視。借鑒國外的防控和凈化經(jīng)驗，當前疫苗的預(yù)防作用意義重大。如何研制出安全性、穩(wěn)定性及免疫效果各方面都均衡的疫苗是未來的發(fā)展方向。通過政府管理部門及科研工作者等各方的努力，我國布病一定會得到有效控制。

   （葛瑞華 龔小林 潘乳玲  江西省南昌縣動物疫病預(yù)防控制中心）