摘要：冷凍造成精子的結(jié)構(gòu)和功能變化是導(dǎo)致繁殖率低的根本原因。筆者通過對比試驗，檢測精液冷凍后對羊繁殖率的影響。用假陰道法采集3只～4只公羊精液，用Tris稀釋液作為冷凍保存液，用TALP作為解凍液，比較精液冷凍前后活力；對同期發(fā)情處理的羊只進(jìn)行鮮精和凍精人工授精，比較兩者在受胎率上的變化。結(jié)果表明，冷凍前后精子活力分別為74.43%和46.25%，受胎率分別為83.33%和47.06%，說明超低溫冷凍通過影響精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，顯著降低了精子活力和受胎率。

    精液冷凍是利用液氮（-196℃）等作為超低溫冷凍源，將經(jīng)過特殊處理的精液長期保存的一種方法，是人工授精的一項重大革新。超低溫冷凍使精液不受時間、地域和種畜生命的限制，最大限度地提高優(yōu)良公畜的利用率，加速品種的育成和改良步伐。在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中，精液冷凍不僅可以使優(yōu)良基因得到無期限的保存，延長公畜使用年限，而且還可減少養(yǎng)殖企業(yè)成本，便于工廠化、規(guī)?；茖W(xué)安排生產(chǎn)，提高養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效益。國內(nèi)外精液冷凍技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但因冷凍易對精液造成諸如頂體受損、質(zhì)膜破壞、畸形等物理變化，滲透壓增高、細(xì)胞脫水等生理變化，從而影響受胎率，阻礙精液冷凍技術(shù)在養(yǎng)羊業(yè)中的發(fā)展。為了在長治市地區(qū)推廣羊精液冷凍技術(shù)，擴大凍精使用率，提升凍精使用的知曉率，實驗人員在當(dāng)?shù)貙d羊精液超低溫冷凍后對繁殖率的影響進(jìn)行了試驗比較。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗動物

    精液來源于本場按種公羊標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，身體健康的2歲～4歲公羊。受試母羊健康無病，經(jīng)產(chǎn)2胎～3胎，經(jīng)同期發(fā)情處理后隨機組合進(jìn)行凍精人工授精試驗。所有羊只采取舍飼 + 放牧方式管理，自由采食青干草，自由飲水。精料主要由玉米、豆粕、麥麩配制而成。

    1.1.2 主要儀器設(shè)備

    TGL-16G高速臺式離心機、光學(xué)顯微鏡、移液槍、恒溫水浴鍋。

    1.2 方法

    1.2.1 采精與精液冷凍處理

    采用假陰道法操作程序采集3只～4只公羊精液，等量混合后用TALP液離心洗滌3次（1000r/min～1500r/min），每次 5min。將上述離心精液用高卵黃Tris 稀釋液作為冷凍保存液，將精子密度稀釋到為2×108/mL，平衡4h。平衡后，按每顆粒0.1mL的劑量在裝有液氮的氟板上滴凍，放入液氮罐中貯存。

    1.2.2 發(fā)情母羊的處理

    選擇受試母羊50只做同期發(fā)情處理，處理方法和藥物使用參照張旭剛等試驗方法進(jìn)行。

    1.2.3 凍精配種

    取裝有解凍液TALP的小試管，挑選大小均等的凍精顆粒，40℃水浴1min～2min，取1粒凍精顆粒迅速投入解凍液中溶解，鏡檢觀察活率在40%以上的，進(jìn)行輸精配種試驗，跟蹤記錄受胎率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 精子活力檢查

    檢查鮮精和解凍后精子活力，結(jié)果見表1。經(jīng)過冷凍后，凍精活力明顯低于鮮精活力。說明冷凍一定程度上對精子形態(tài)結(jié)構(gòu)造成了損害，降低了精子活力。

    2.2 發(fā)情效果

    觀察和統(tǒng)計1個發(fā)情周期內(nèi)羊只發(fā)情率。結(jié)果見表2。

    經(jīng)過PMSG處理后，羊只同期發(fā)情率為 81.39%。在羊只處理過程中，部分羊只植栓不到位，造成脫栓，降低了羊群整體發(fā)情率。

    2.3 受胎率比較

    鮮精和解凍后精子受胎率比較，結(jié)果見表3。凍精活力直接關(guān)系著受胎率。從表中可以看出，鮮精受胎率（83.33%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于凍精（47.06%）。

    3 討論

    精子成活率是受胎率的直接關(guān)系因素。在冷凍操作過程中，影響精子成活率的因素較多（如稀釋液配制及倍數(shù)、精清過濾、冷凍速率快慢等）。多名研究人員采取了不同的方法，得到的結(jié)果十分接近。毛曉林等對安哥拉山羊進(jìn)行的研究，其解凍后活率僅為0.36，情期受胎率則達(dá)到63.74%；趙曉娥等報道,應(yīng)用細(xì)管保有存波爾山羊精液，其活率最高可達(dá)0.60；徐剛毅等、朱明齊等對波爾山羊冷凍精液進(jìn)行解凍，其凍后活率僅為0.3～0.4左右。

    3.1 稀釋液

    對精液進(jìn)行適當(dāng)稀釋可以提高精子的成活率，也可擴大精液授精范圍，而不同的稀釋液對解凍后精子的活率影響也很大。當(dāng)前，應(yīng)用最廣泛的精液稀釋液是卵黃+Tris葡萄糖稀釋液，它使精子能夠很好地保存。徐振軍等試驗使用的葡萄糖稀釋液和檸檬酸鈉稀釋液，使解凍后精子的活率保持在0.5以上，遠(yuǎn)高于對照組，這說明稀釋液直接關(guān)系著精液冷凍解凍后精子的生存活率。精液稀釋倍數(shù)對精子也存在不同的影響。稀釋倍數(shù)過大，精子的存活率反而會隨著稀釋倍數(shù)的增加逐漸降低，最終影響受胎率。這可能是由于隨著稀釋倍數(shù)的增加，單位體積稀釋液里的精子數(shù)量下降，導(dǎo)致受胎率降低。Sminov等研究證實稀釋比例從5倍增加至11倍時產(chǎn)羔率下降。丁瑜等在實驗中得出結(jié)論，綿羊最佳稀釋比例為1∶3。

    3.2 精清

    冷凍過程會造成精子超微結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)頂體囊泡化（即假頂體反應(yīng)）、線粒體尾部受損等一些可逆性損害。在未去除精清的情況下，這種傷害作用會同冷凍 - 解凍過程中的傷害作用結(jié)合，對精子的損傷更為嚴(yán)重。而去除精清則可降低這種傷害作用，使精子所受的冷凍損傷大為減輕。

    3.3 冷凍

    水在緩慢降溫冷凍過程中易形成冰晶。精液中含有約 90%的自由水，精子中也含有少量水分，在精液冷凍過程中，緩慢降溫極易引起精子細(xì)胞內(nèi)外所發(fā)生一系列的理化變化。雖然冰晶引起精子損傷的機制還了解得很少，但比較明顯的基本變化可歸納為單位膜完整性被冰晶破壞，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差增高，細(xì)胞脫水，進(jìn)而精子形態(tài)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致精子發(fā)生不可逆變化而死亡，降低精子存活率。

    4 結(jié)論

    經(jīng)過幾十年的發(fā)展，我國畜禽精液冷凍保存技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展，尤其是牛、羊凍精生產(chǎn)與應(yīng)用已經(jīng)很成熟，但凍精在養(yǎng)羊業(yè)中的應(yīng)用目前還不是很普及，重要原因就是凍精受胎率仍遠(yuǎn)低于鮮精。

    精液冷凍技術(shù)的研究還面臨著諸如稀釋液配制、解凍等一些技術(shù)瓶頸，冷凍仍然會對精子細(xì)微結(jié)構(gòu)造成不可逆的變化，如單位膜完整性遭到破壞、細(xì)胞內(nèi)外滲透壓增高等，甚至可能存在精子蛋白質(zhì)變性、氨基酸損失等情況，這些需要通過更深入的研究得以佐證。

    總之，雖然以上這些因素造成冷凍精液解凍活力低、受胎率低，但隨著新技術(shù)的發(fā)展，凍精在擴大畜禽養(yǎng)殖規(guī)模，會畜禽工廠化、規(guī)?；a(chǎn)中必將發(fā)揮重要的作用。如何讓冷凍對精子結(jié)構(gòu)和功能的影響降到最低，減少低溫冷凍對精子結(jié)構(gòu)的破壞，采取科學(xué)的保護(hù)措施提高精子的成活率需要我們進(jìn)一步研究論證。

   （郭偉彪  山西省長治市郊區(qū)馬廠畜牧獸醫(yī)中心站；張旭剛  山西省長治市郊區(qū)堠北莊畜牧獸醫(yī)中心站；李軍  山西省長治市郊區(qū)老頂山畜牧獸醫(yī)中心站）