[摘要] 本試驗選用0、200、400、600、800、1000U/mL 6個濃度梯度的2709堿性蛋白酶水解脫脂豆粕，研究酶濃度對脫脂豆粕水解效果的影響。結(jié)果表明，隨著酶濃度的增加，豆粕氮溶質(zhì)數(shù)、酸溶性氮得率、豆粕蛋白水解度及水解液中氨基酸含量不斷增大；豆粕蛋白得率呈顯著降低趨勢。綜合各指標試驗結(jié)果得出，利用2709堿性蛋白酶水解豆粕，適宜條件為pH9.8，酶濃度400U/mL，48.5℃，保溫5h。

    研究表明，和游離氨基酸相比，機體對肽的吸收更迅速，利用率更高，大豆蛋白肽以其促生長、增強免疫的功能日益被人們重視。豆粕蛋白質(zhì)含量豐富，價格低廉，是商業(yè)生產(chǎn)大豆蛋白肽的理想原料。本文通過研究不同酶濃度對豆粕水解效果的影響，進一步驗證了利用2709堿性蛋白酶水解生產(chǎn)大豆蛋白肽的適宜條件，以期為酶水解豆粕的商業(yè)化生產(chǎn)提供資料參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    脫脂豆粕：河南正大畜禽有限公司，粗蛋白含量為44.1%，脂肪含量為1.2%，無霉變，干燥，粉碎至60目以上；2709地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶（100×104U/g）：邢臺思倍特生物科技有限公司；蒸餾水；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉等試驗試劑均為分析純。

    1.2 主要設(shè)備

    全自動凱氏定氮儀（KjeltecTM 2300）；恒溫磁力攪拌器；離心機；水浴鍋；電子分析天平；pH酸度計；勻漿機。

    1.3 測定指標及方法

    1.3.1 氮溶質(zhì)數(shù)（Nsi）

    取一定量豆粕按1︰7.5比例加水（或酶液）維持pH =9.8，48.5℃下，保持5h 后過濾，少量水沖洗濾渣，合并濾液，加熱到75℃，水浴鍋保溫1h，使酶失活，測定濾液含氮量并計算Nsi。

    1.3.2 酸溶性氮得率

    等電點濾液中可溶性氮與所加豆粕的總含氮量之比即為酸溶性氮得率。

    1.3.3 蛋白質(zhì)水解度（DH）

    DH的定義是蛋白質(zhì)水解過程中，被斷裂的肽鍵數(shù)與給定蛋白的總肽鍵數(shù)之比，由下式計算得出：DH（%）=打斷的肽鍵數(shù)目總的肽鍵數(shù)目×100

    1.3.4 水解液中氨基酸甲醛滴定法測定。

    1.3.5 蛋白得率

    調(diào)節(jié)濾液pH值在大豆蛋白質(zhì)等電點（pH =4.5），使濾液蛋白質(zhì)沉淀，計算沉淀蛋白量與加入的豆粕總蛋白量之比。

    1.4 酶處理步驟

    ⑴豆粕粉分別與不同質(zhì)量的堿性蛋白酶按照1：7.5比例加水勻漿。

    ⑵滴加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH =9.8，蓋上薄膜，調(diào)最適溫度。

    ⑶固定時間調(diào)節(jié)pH ，保持溶液的堿度。試驗開始每隔5min 滴定一次；半小時之后，每隔15min進行調(diào)節(jié)。每次記下消耗的堿量。試驗過程中水位低于刻度線，加水補充。

    ⑷水解5h后迅速加熱至75℃，恒溫1h。

    ⑸冷置，200目過濾，沖洗，沖洗液進入濾液。

    ⑹將濾液1500r/min、離心10min，取上清液，250mL定容。得到濾液1。

    ⑺分別用甲醛法、凱氏定氮法測定濾液1中氨基酸的含量和氮溶質(zhì)數(shù)。

    ⑻滴加硫酸調(diào)節(jié)pH至4.5，靜置3h，4000r/min，離心10min，棄上清液，得蛋白質(zhì)沉淀，烘干，稱重。測定蛋白得率和酸溶性氮得率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理時間對豆粕DH的影響
    為了確定最佳的水解時間，我們首先選擇200和400U/mL兩種酶濃度，進行預(yù)試驗。處理結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，不論200U/mL還是400U/mL酶濃度水解豆粕蛋白質(zhì)水解度都在處理5h左右趨于穩(wěn)定，雖然隨著處理時間的增加，DH值還有變化，但考慮到生產(chǎn)成本和效益，我們認為酶解豆粕的適宜時間為5h。

    2.2 不同濃度酶處理對豆粕氮溶質(zhì)數(shù)的影響
    不同濃度酶處理對豆粕Nsi的影響見圖2，從圖2可以看出，pH =9.8，豆粕中不添加酶時，Nsi為55.18%，表明pH =9.8 的堿性條件有利于豆粕蛋白的水解。豆粕 Nsi隨著水解蛋白酶濃度變化不斷變化，當酶濃度從200U/mL升高到400U/mL時，豆粕Nsi也不斷增大，但當酶濃度大于400U/mL時，豆粕Nsi增加幅度顯著降低。因此，可以初步判定豆粕水解的適宜蛋白酶濃度為400U/mL。

    2.3 不同濃度酶處理對豆粕酸溶性氮得率的影響
    酸溶性氮得率是檢驗酶對蛋白水解能力的評估指標。由圖3可知，隨著酶濃度的增加，酸溶性氮得率也隨之增大，但酶濃度大于200U/mL時上升幅度顯著降低。當酶濃度為800U/mL時，酸溶性氮得率達到79.79%，絕大部分的蛋白質(zhì)都變成了可溶性的蛋白降解物。

    2.4 不同濃度酶處理對豆粕水解液中氨基酸的影響
    測定水解液中氨基酸的量是選擇合適水解程度的一個依據(jù)。豆粕中的蛋白質(zhì)在水解時，可產(chǎn)生氨基酸和多肽，而多肽還可以進一步水解成氨基酸。2709堿性蛋白酶專一性很差，需要控制好試驗條件才可以在減少水解液中氨基酸的同時，經(jīng)濟、高效地得到肽溶液。經(jīng)過甲醛法測定，由圖4可知，隨著酶濃度的增加，水解液中氨基酸含量也隨之增加，但酶濃度從200至800U/mL，氨基酸的量均小于大豆蛋白降解肽的質(zhì)量指標中的相關(guān)規(guī)定（氨基酸氨占總氨的百分比≤12.6%）。

    2.5 不同濃度酶處理對豆粕產(chǎn)物蛋白得率的影響
    由圖5可知，酶濃度為0時，豆粕水解產(chǎn)物的蛋白得率為40.21%，酶濃度為200U/mL粕中添加蛋白酶可減少豆粕水解產(chǎn)物中蛋白含量，促進豆粕水解。隨著酶濃度的增加，雖然蛋白得率不斷下降，但酶濃度大于200U/mL時下降幅度不大。

    3 討論

    通過上述對水解反應(yīng)中幾項指標的研究，我們發(fā)現(xiàn)酶濃度超過400U/mL，生產(chǎn)性能沒有顯著的提高；在200U/mL與 400U/mL情況下，不僅生產(chǎn)性能相似，而且成本也是較低的。因為生產(chǎn)時酶有損耗，所以酶濃度為400U/mL是最符合生產(chǎn)實際的參數(shù)。表1是選擇酶濃度為400U/mL時的幾項試驗數(shù)據(jù)，滿足所需肽溶液營養(yǎng)需要。
    4 結(jié)論

    由試驗結(jié)果可以得出，酶可以促進豆粕中蛋白的水解，當pH=9.8，2709堿性蛋白酶（100×104U/g），最適生產(chǎn)濃度為400U/mL，48.5℃保溫5h時水解度為26.7%，水解液中含氮78%~80%；蛋白得率5.87%，酸溶性氮得率73.08%；游離氨基酸9.63%。

    （盛東峰  周口師范學院）