酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是獸醫(yī)疫病監(jiān)測與防控中經(jīng)常使用的一種試驗(yàn)方法。因其較高的靈敏性和特異性，以及適于批量操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛被應(yīng)用于抗體或抗原的檢測中。但是該試驗(yàn)對試驗(yàn)操作要求較高，一些細(xì)節(jié)操作不當(dāng)會對試驗(yàn)結(jié)果造成很大偏差。本文就ELISA試驗(yàn)中應(yīng)注意的一些細(xì)節(jié)進(jìn)行探討。

    1  樣品的采集和保存

    ELISA試驗(yàn)最常用的是血清樣品。為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，血清的采集和保存尤為重要。首先應(yīng)避免溶血。因?yàn)檠t蛋白中的類過氧化物活性物質(zhì)會與試驗(yàn)過程中的辣根過氧化物酶反應(yīng)，造成假陽性的發(fā)生。其次，樣品采集過程中應(yīng)盡量保證無菌操作，減少污染。為了保證樣品的有效物質(zhì)不被降解，同時(shí)避免樣品發(fā)生腐敗，采集的樣品于4℃短期保存。如需長期保存，則應(yīng)-20℃°或-70℃保存，并避免反復(fù)凍融。

    2  試劑的準(zhǔn)備

    目前有很多商品化的ELISA試劑盒可供選擇，省去了很多試劑的準(zhǔn)備工作。但是商品化的試劑盒在使用前也有很多注意事項(xiàng)。首先，ELISA試驗(yàn)對室溫的要求一般為18~26℃。有的反應(yīng)步驟要求37℃恒溫。因此，實(shí)驗(yàn)室首先得滿足實(shí)驗(yàn)條件，具備溫控系統(tǒng)和恒溫箱。在試驗(yàn)前于4℃保存的試劑盒必須恢復(fù)至18~26℃后方可使用。應(yīng)注意每種試劑是否符合實(shí)驗(yàn)要求，如檢查TMD底物是否已經(jīng)顯色變質(zhì)，對不符合試驗(yàn)要求的試劑棄用，嚴(yán)禁用于后續(xù)試驗(yàn)。

    3  溫育反應(yīng)時(shí)間的控制

    因?yàn)镋LISA是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)，依據(jù)酶標(biāo)結(jié)合物和底物的顯色差異來進(jìn)行試驗(yàn)判斷，而酶促反應(yīng)對反應(yīng)時(shí)間又有很高要求，因而ELISA試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，縮短或延長反應(yīng)時(shí)間，會造成試驗(yàn)失敗和準(zhǔn)確性降低。

    4  洗板

    為了確保ELISA測定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號，增加分析的信噪比。在洗板過程中，應(yīng)注意避免液體濺出或者加液過程造成的反應(yīng)孔交叉污染，同時(shí)在洗板結(jié)束后對板子進(jìn)行拍干，并用洗耳球吹去反應(yīng)孔底部的氣泡。洗板與下一步的加液過程不應(yīng)間隔過長時(shí)間，否則會造成反應(yīng)孔底部包被結(jié)合物變干。每一步孵育過程均應(yīng)對反應(yīng)板加蓋封口膜，以防液體揮發(fā)。

   （陳光麗  河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）